JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59275
, , , , ,
1Department of Hematology & Hematopoietic Cell Transplantation, T Cell Therapeutics Research Laboratory,City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center, 2Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences,City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center

Summary

Burada, antitümör T hücre etkinlik fenotipik ve fonksiyonel analiz için izin veren bir tüp bebek ortak kültür yöntemi yinelemeli olarak meydan tümör hedefli T hücreleri, açıklayın.

Abstract

Chimeric antijen reseptör (araba) T hücre tedavisi alan araba tasarım, gen Mühendisliği yaklaşımlar ve üretim en iyi duruma getirmeleri iyileştirmeler ile hızla ilerlemektedir. Bu geliştirme çabaları için bir meydan okuma ancak, sağlam içinde vivo tedavi başarı için en iyi araba T hücre ürünlerin seçimi bilgilendirebilir tüp bebek deneyleri kurulması olmuştur. Standart tüp bebek tümör lizis deneyleri sık araba T hücreleri kısa ortak kültür zaman ve yüksek T Hücre Tümörü oranı nedeniyle antitümör gerçek potansiyelini yansıtmak başarısız. Burada, potansiyeli yüksek tümör hücre yüklerde öldürme araba T hücre özyinelemeli değerlendirmek için bir tüp bebek ortak kültür yöntemi açıklanmaktadır. Bu tahlil, uzun vadeli sitotoksik fonksiyon ve araba T hücrelerinin proliferatif kapasite vitro ortak kültür her geçen gün idare ek tümör hedefleri olan 7 gün içinde incelenir. Bu tahlil profil T hücre aktivasyonu, bitkinlik ve bellek fenotipleri ile birleştiğinde olabilir. Bu tahlil kullanarak, biz başarıyla CD4 arasında işlevsel ve fenotipik farklılıklar seçkin+ ve CD8+ araba T hücreleri glioblastoma karşı (GBM) hücreleri, orthotopic fark onların içinde vivo antitümör etkinliğinde yansıtan xenograft modelleri. Bu yöntem araba T hücre potansiyeli değerlendirmek için ve farklı araba T hücre ürünler arasında işlevsel farklılıklar aydınlatmak için facile bir yaklaşım sağlar.

Introduction

Chimeric antijen reseptör (araba) kullanarak immünoterapi-mühendislik T hücreleri B hücre maligniteler1,2,3,4, diğer tümörler hedefleme potansiyeli ise karşı umut verici sonuçlar gördü titiz soruşturma5,6,7altında olmaya devam etmektedir. Büyük ilerleme araba yapı, üretim süreci ve hasta öncesi infüzyon rejimleri6,7,8en iyi duruma getirmek için yapılan ve roman sentetik Biyoloji yaklaşımlar artış bekleniyor onların Persistence, Emanet ve tümör özgüllük9,10. Ancak, zor ve emek yoğun uygun klinik çeviri için en iyi seçimdir rehberlik için araba T hücreleri tedavi potansiyelini değerlendirmek için olmuştur. En köklü şu ana kadar araba T hücre işlevi değerlendirmek için insan tümör xenografts, mademki araba T hücreleri antitümör etkinliği için muayene ve titre hücre doz11,12 , karşılaştırıldığında taşıyan immünyetmezligi farelerde modelidir , 13 , 14 , 15. emek ve zaman alıcı, bu içinde vivo fare çalışmalar ne zaman özellikle parametreleri çok sayıda eleme. Ayrıca, içinde vivo çalışmalar fare suşları, hayvan bakım tesisleri ve hayvan işleme teknikleri erişilebilirlik tarafından hakim. Bu nedenle, bu T hücrelerinin içinde vivo antitümör işlevi de sadakatle yansıtan hızlı okumayı efektör aktivitesinin için izin daha uygun tüp bebek deneyleri geliştirmek için gerek yoktur.

Tüp Bebek T hücrelerinin sitotoksisite belirlemek için geleneksel yöntemlerle degranulation, sitokin üretim ve Radyoizotop etiketli hedef hücreleri (yani, krom yayın deneyleri) koşullar yeteneği algılamayı odaklanmıştır. Bu deneyleri araba T hücre özgüllük ve yeniden yönlendirilen hedef tanıma tanımlamak için bilgilendirici olsa da, sık sık mühendislik T hücreleri12,13,16içinde vivo antitümör potansiyelini yansıtmak başarısız. Belirli durumlarda, vitro kısa vadeli deneyleri etkinliğinde öldürme içinde vivo antitümör işlevi16ile ters bir korelasyon gösterdi. Tür tutarsızlık büyük olasılıkla bu tüp bebek deneyleri ve yetersizlik bu nedenle yorgunluk17‘ ye yatkındır araba T hücre ürünleri ayırt etmek için kullanılan yüksek efektör: hedef (E:T) oranları sonucudur. Buna karşılık, içinde vivo tümör imha sırasında T hücreleri genellikle böylece öldürmek ve daha sonra T hücre farklılaşma ve yorgunluktan18,19, birden fazla mermi gerektiren büyük tümör yükünü karşı yanıt bir araba T tarafından etkili tümör izni karşı büyük engeli olan 20,12,13hücreleri. Bu arada, araba T hücre tedavi hastalarda araba T Hücre genişletme için kapasitesi güçlü klinik yanıt4ile ilişkilidir, ancak en kısa vadeli tüp bebek ölüm deneyleri de T hücre çoğalması, değil okuma farklılıkları yok. Böylece, uygun tüp bebek tahlil yüksek tümör yükü, T hücre bitkinlik, indüksiyon şartları özetlemek gerekir ve T Hücre genişletme göstergesi için sağlar.

Burada araba T hücreleri tekrarlayan tümör basit tüp bebek ortak kültür tahlil ile potansiyel öldürmek için değerlendirmek için bir strateji tanımlarlar. Farklı T hücre efektör etkinlik parametreleri aynı anda, hedef hücre öldürme, araba T hücresi genişletmeye ve bellek veya tükenme ilişkili fenotipleri gibi incelenebilir. Bu tahlil oluşturulan sonuçların iyi içinde vivo antitümör Etkisi araba T hücreleri ile ilişkilendirmek ve araba T hücre ürünlerin potens değerlendirmek için yararlanılabilir. Biz birincil GBM satır21karşı IL13Ra2 hedefli araba T hücreleri değerlendirmek için bir tahlil tarif ederken, herhangi bir araba T hücre platforma kolayca uyarlanabilir.

Protocol

Bizim IRB inceleme bu protokol gerektirmez. Şehir, umut patoloji kodlu bölümden atılan taze glioblastoma tümör örnekleri almak ve bizim laboratuvar anahtar erişim sağlayamaz. Örnek veriler yalnızca önceki tedavi ve hastalık durumu ile biyopsi/rezeksiyon, tanımlayıcı veri içermeyen zaman alırsınız. 1. medyası hazırlama Nöral kök hücre medya birincil GBM hücre hatları kültür için hazırlamak: DMEM:F12, 1:50 B27, 5 µg/mL heparin ve 2 mmol/L L-glutamin; haftada iki kez 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 20 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü (FGF) ile desteklenmiştir ( Tablo malzemelerigörmek). T hücre ortam hazırlamak: X-VIVO 15 içeren % 10 fetal buzağı serum (FCS); 70 IU/mL rhIL-2 ve 0,5 ng/mL rhIL-15 ile her 48 s ( Tablo malzemelerigörmek) desteklenmiştir. Ortak kültür ortamı hazırlamak: nöral kök hücre medya EGF ve FGF ek olmadan alıp % 10 FCS ekleyin. Çözüm (FSS) Boyama FACS hazırlamak: HBSS, %2 FCS, NaN3 (0.5 g/500 mL). 2. GBM tümör hücreleri hazırlanması Santrifüjü 300 x g 4 dk için de tarafından düşük geçiş GBM tümör küreler (TDH) hasat ve süpernatant atın.Not: GBM tümör küreler (TDH) oluşturulan22,23,24daha önce açıklandığı gibi tümör rezeke ve nöral kök hücre medyada İnkübatörler 37 ° C’de % 5 CO2 ile saklanır. Önceden sıcak ortak kültür medyada 37 ° C su banyosu. 1 mL soğuk accutase GBM TDH’de ekleyin, 30-60 s için pipetting tarafından TSs ayırmak ve ayrılma 5 mL sıcak ortak kültür ortamının ekleyerek durdurmak.Not: GBM TSs accutase fazla 5 min için üzerinde tutulmalıdır değil. Santrifüjü 300 x g 4 dk için de tarafından GBM hücre hasat, süpernatant atmak ve ortak kültür ortamının 2 mL hücrelerde resuspend. Bir hücre canlılığı sayaç kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek.Not: Hücre canlılığı olması gerekir > % 70. 3. araba T hücreleri hazırlanması Az 24 saat önce tahlil, bir Akış Sitometresi tüpüne kültürlü araba T hücrelerinin 100 µL alıp FSS 2 mL ekleyin.Not: Araba T hücreleri11,21 daha önce açıklandığı gibi oluşturulan ve T hücre medyada kültürlü. Santrifüjü 300 x g 4 dk ve atma süpernatant için de. Hücreleri, 4 dk, 300 x g , santrifüj yıkamak için FSS 2 mL ekleyin ve süpernatant atın. Araba ifade için 30 dk 4 ° C’de belirtmek için uygun antikor hücrelerle leke.Not: Örneğin, bir IL13Rα2 hedefli araba tarif varsa daha önce25 kullanılan, daha sonra anti-IL13 antikor ile leke. FSS iki kez 2 mL ile yıkayın ve araba exn Akış Sitometresi kullanarak çözümleyebilirsiniz. Şekil 1’Bgösterilen gating strateji kullanarak T hücreleri üzerinde araba % belirlemek. Ortak kültür gün, tüm araba T hücreleri tarafından Santrifüjü 300 x g 4 dk için de hasat, süpernatant atmak ve ortak kültür ortamının 2 mL hücrelerde resuspend. Bir hücre canlılığı sayaç kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek.Not: Hücre canlılığı olması gerekir > % 70. 4. Kurulum tümör — T hücre ortak kültür Tümör hücreleri 0.16 milyon/mL ortak kültür medya ile bir konsantrasyon için sulandırmak. Araba % bağlı olarak, konsantrasyonu 0,04 milyon araba+ hücre/mL ile ortak kültür kitle iletişim araçları için araba T hücreleri oranında seyreltin.Not: Örneğin, araba % 50 ve T hücre konsantrasyonu 0,4 milyon/mL ise, sonra son konsantrasyonu 0,04 milyon araba+ hücre/mL almak için 1:5 seyreltme yapın. 100 µL seyreltilmiş tümör hücrelerinin bir 96-şey düz-alt doku kültürü tabak her kuyuya pipet. 100 µL seyreltilmiş araba T hücrelerinin tümör hücreleri ve mix de içeren her kuyuya pipet.Not: Her tümör-T hücre ortak kültürü 4 saat noktalarda incelenecek. her zaman noktası farklı çözümleme, bağlı olarak 4-6 çoğaltır, gerekli olabilir ama < her zaman noktası 3 çoğaltır tavsiye edilmez; bkz. Tablo 1 için temsil edici bir platemap. Plaka bir 37 ° C’de % 5 CO2 kuluçka korumak. 5. tümör hücre Rechallenge Not: Rechallenge 2, 4 ve 6 gün sonrası ilk ortak kültür Kur (şekil 1A) gerçekleşir. Hasat ve GBM TSs (yukarıdaki adımları 2.1-2.6) açıklandığı gibi ayırmak. GBM hücreleri 0.64 milyon/mL bir konsantrasyon, resuspend. Rechallenge gereken ortak kültür wells belirlemek (bkz. Tablo 1) ve her şey üst kısmından 50 µL medya dikkatli bir şekilde çıkarın. GBM hücre süspansiyon 50 µL her kuyunun içine ekleyin ve iyice karıştırın, sonra plaka geri bir 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka makinesi koymak. 6. hasat örnekleri ve akış sitometrik analizi Not: Örnekleri sırasıyla tümör meydan, 1, 2, 3 ve 4 ile ilk ortak kültür kurulumu yuvarlar 1, 3, 5 ve 7 gün post adlı hasat edilecek. Önceden sıcak % 0.05 tripsin-EDTA çözümde 37 ° C waterbath. Hasat gerekir ve yeni bir yuvarlak alt 96-şey plaka medya transfer wells belirlemek. Tripsin-EDTA 50 µL pipet kalan tümör hücreleri 5 min için 37 ° C’de sindirmek için kuyu içine. Mikroskop altında hücreleri alttan bağlantısız onayla. Pipet müstakil hücreleri resuspend, o zaman tripsin-EDTA yuvarlak alt 96-şey plaka karşılık gelen kuyu için ayrılmış hücreleri içeren transfer için iyi alt etrafında. Santrifüj yuvarlak alt 96-şey plaka 300 x g, 4 ° C 4 dk için sonra süpernatant atmak. Hücreleri, 300 x g, santrifüj, 4 ° C 4 dk için yıkamak için FSS 200 µL/kuyu ekleyin, sonra süpernatant atmak. Resuspend ( Tablo malzemelerigörmek) 100 µL/iyi FSS içeren antikor hücreleri ve leke için 30 dk 4 ° C’de hücreler. 100 µL/iyi FSS hücrelere ekleme, 300 x g, 4 ° C 4 dk için sonra atma süpernatant santrifüj kapasitesi. Hücreleri, 300 x g, santrifüj, 4 ° C 4 dk için yıkamak için FSS 200 µL/kuyu ekleyin, sonra süpernatant atmak. 100-200 µL/kuyu ile 500 ng/mL DAPI FSS hücrelerle resuspend sonra Akış Sitometresi tarafından örnekleri analiz. 7. işlevsel ve Fen Otypic analiz araba T hücreleri Akış Sitometresi veri dosyalarını almak ve tüm canlı (DAPI-) hücreleri (şekil 1C) kapı. Tümör hücreleri CD45 çoğunluğuna göre ölçmek- nüfus ve CD45 çoğunluğuna göre araba T hücreleri+, araba + nüfus (şekil 1C).Not: Tümör hücreleri CD45 ifade edersek (örneğin Raji Lenfoma hücreleri), anti-CD3 boyama tümör hücreleri T hücrelerden ayırt etmek için kullanılabilir. Arsa tümör hücre ve araba T hücre sayısı saat ders. T hücre aktivasyonu 4-1BB ve CD69 ortak ifade tarafından tanımlayın.Not: Bu yüzey işaretleyicileri T hücre harekete geçirmek 6-24 h sonrası ilk ortak kültürü analiz etmek için kullanılabilir. T hücre tükenme PD-1, LAG-3 ve TIM-3 ifadesi tarafından tanımlayın. T hücre bellek durumu CD45RO ve CD62L ifade tarafından tanımlayın.

Representative Results

Yukarıda açıklanan tahlil kullanarak, biz fark efektör kudret seçkin ve dinamikleri öldürme aracılı CD4 tarafından+ ve CD8+ araba T hücreleri. Burada sunulan sonuçlar CD4 arasındaki farkı göstermek+ ve CD8+ araba T hücreleri, sağlıklı bir donör önceki yayın21bağımsız oluşturulan. Bir standart degranulation yöntemi, biz her iki gözlemlemek başardık CD4+ ve CD8+ araba T hücreleri-oldu aynı derecede aktif hedeflenen antijen hızlı GBM hücreleri karşı CD107a ve hücre içi sitokin ifade tarafından belirtildiği gibi (Şekil 2A). Ancak, tekrarlayan tümör meydan tahlil kullanarak, bulduk CD4+ ama değil CD8+ araba T hücreleri birden çok yönlü öldürme (Şekil 2B) kapasitesini sergiledi. CD4+ araba T hücreleri de CD8 + hücreleri ile karşılaştırıldığında elde daha iyi genişleme sırasında bu tahlil (Şekil 2C). Genişleme araba T hücre alt kümeleri arasında fark sadece gözlendi D3 tümör meydan (1:12 E:T), iki tur sonra sitotoksisite fark gözlendi iken D5 tümör meydan (1:20 E:T) üç tur sonra başlayan, gösteren kısa vadeli deneyleri farklı araba T hücre ürünlerin potens farklılıkları aydınlatmak başarısız oldu. Otelde 1:1 karışık CD4+ ve CD8+ araba T hücreleri bu tahlil için uygulanan, onlar CD8 daha iyi performans için bulunamadı+ CD4 değil ama+ araba T hücreleri uzun vadeli sitotoksisite (Şekil 2B). CD8 genişlemesi+ araba T hücreleri tarafından ortak uygulanan CD4 indüklenen+ hücreleri, CD4+ araba T hücresi genişletmeye CD8 huzurunda inhibe+ hücreleri (Şekil 2C). Efektör etkinlik CD4 arasında ayıran mekanizması açıklamak için+ ve CD8+ araba T hücreleri, biz öncelikle onaylamak o 24 saat sonra ilk ortak kültür, her iki CD4+ ve CD8+ araba T hücreleri olduğunu kıyaslanabilir aktif (şekil 3 A). CD45RO ve CD62L ifade, her iki CD4 tarafından belirtildiği gibi bu arada,+ ve CD8+ araba T hücreleri gösterdi bir geçiş Merkezi bellekten (CD45RO+, CD62L+) efektör belleğe (CD45RO+, CD62L-) fenotip sırasında tekrarlayan tümör meydan okuma (şekil 3B). O zaman biz D3 Bu testin, hücreleri ile karakterize araba T hücre alt kümeleri işlevsel farkı görüntüler başlamadan bir saat. T hücre tükenme inhibitör reseptörler PD-1, LAG-3 ve gösterdi TIM-315,21, ortak ifade tarafından kutlandı o CD8+ araba T hücreleri CD4 ile karşılaştırıldığında yorgunluk eğilimli daha+ araba T hücreleri () Şekil 3 C). Ayrıca, hiçbir fark CD8 üzerinde görüldü+ birlikte uygulanan CD4 varlığı/yokluğunda araba T hücre tükenme+ hücreleri (şekil 3C), gösteren o CD4 kaynaklı CD8+ araba T hücresi genişletmeye değil daha iyi bir efektör fonksiyonu ile ilgili. Birlikte, bu tahlil sonuçlarından o CD4 tespit+ araba T hücreleri CD8 geride+ hücreleri uzun vadeli sitotoksisite özellikle. Benzer kısa vadeli sitotoksisite (1-3 gün bir kez rechallenged), CD4 rağmen+ araba T hücreleri CD8 sırasında tekrarlayan tümör meydan okuma üzerine sürekli efektör işlevi+ hücreleri bitkin ve tümör hücre büyümesini kontrol etmek için başarısız oldu. Ne zaman iki alt kümeleri karışık, CD4+ araba T hücreleri CD8 genişlemesi kolaylaştırdı+ araba T hücreleri, CD8 bitkinlik durumu+ hücreleri değil iyileştirmiştir, iki grup arasında sinerjik etkisi olmaması sonuçlanan. CD4 arasındaki benzer fark+ ve CD8+ araba T hücreleri içinde vivo bir modelde yukarıda açıklanan21görüldü. Nitekim, CD8+ araba T hücreler antijen pozitif nüks ile; kısa vadeli tümör izni takip ama arabuluculuk başardık Buna karşılık, CD4+ araba T hücre tedavisi sonuçlandı uzun vadeli tümör imha21′, hangi tüp bebek rechallenge tahlil kullanarak kendi tekrarlayan öldürme potansiyeli anımsatır. Resim 1 : Tekrarlayan meydan tahlil şema ve analiz bir strateji. (A)şema ve tekrarlayan tümör meydan testin zaman çizelgesi. Her şey için araba T hücreleri ilk PBT030-2 GBM hücreler (4.000 araba + hücreler, 16.000 tümör hücreleri) Co kültürlü ve 32.000 tümör hücreleri ile her geçen gün (D2, D4 ve D6) yeniden meydan. Analiz tümör hücre ve araba T hücre sayısı, hem de araba T hücre fenotip D1, D3, D5 ve D7 yapılır. (B) araba % t belirlemek için strateji çoğunluğuna hücreleri co kültürünü ayarlamadan önce. (C) strateji canlı hücreleri, tümör hücreleri ve tekrarlayan meydan tahlil araba T hücrelerden geçişi. Untransduced T hücreleri ile birlikte kültürlü rechallenge testin farklı zamanlarda numarası (D) tümör hücreleri. Hata çubukları ±SEM. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : Tekrarlayan meydan tahlil öldürme ve proliferatif etki gücüne CD4 arasındaki farkları ortaya+ ve CD8+ araba T hücreleri. (A)Degranulation ve hücre içi sitokin CD4 boyama+ ve CD8+ araba T hücreleri ortak kültür 5 h sonra GBM hücrelerle (E:T = 1:1). (B) CD4+, CD8+ veya karışık (CD4:CD8 = 1:1) araba T hücreleri tekrarlayan meydan tahlil için uygulandı ve canlı tümör hücreleri sayılabilir. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 CD4 ile karşılaştırıldığında+, tek yönlü ANOVA Bonferroni’nın birden fazla karşılaştırma testlerle kullanma. (C) CD4+ ve CD8+ araba T Hücre genişletme sırasında tekrarlayan tümör meydan tahlil. (Soldan sağa) karşılaştırılması CD4+ vs CD8+, tek alt; CD4+ vs CD8+, “Karma” grubundaki; CD4+, tek vs karışık; CD8+, tek karışık vs. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 unpaired bir öğrenci t testi kullanarak. Hata çubukları ±SEM. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : T hücre fenotip tekrarlayan meydan tahlil sırasında analizini. (A)4-1BB ve CD69 araba T hücreleri, D1 testin üzerinde boyama. (B) CD45RO ve CD62L araba T hücrelerinin (giriş) tahlil rechallenge için uygulamadan önce ve D3 ve testin D7 boyama. (C) ortak ifade PD-1, LAG-3 ve TIM-3 araba T hücreleri, D3 testin üzerinde. (Üst) 1, 2 veya 3 inhibitör reseptörler ifade T hücreleri tanımlamak için stratejiler geçişi. (Alt) Karşılaştırma: CD4+ hücreleri (tek alt), CD8+ hücreleri (tek alt), CD8+ hücreleri (“Karma” grubunda). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Tablo 1: Temsilcisi plaka rechallenge Kur Haritası.

Discussion

Bu tekrarlayan tümör hücre meydan tahlil araba T hücre fonksiyonel kudret, içinde vivo tümör modelleri ile ilişkili yüksek tümör yükünü beyannamedir bir tüp bebek Kurulumu kullanarak değerlendirmek için uygun bir yaklaşım sağlar. Bu 7 günlük tahlil sırasında araba T hücrelerinin tümör Challenge (ilk ortak kültür ve 3 x rechallenge), dört mermi geçmesi nerede yorgun T hücrelerinin tümör challenge rağmen güçlü bir ilk yanıt için yanıt vermek için onların yeteneği kaybetmek bir ortam yaratır. Tümör hücre ortadan kaldırılması ve araba T hücresi genişletmeye fenotipleri araba T hücreleri, T hücre aktivasyonu belirten yüzey veya hücre içi işaretleyicileri boyama tarafından kolayca çözümlenebilir iken bu tahlil, elde edilebilir iki temel veriler temsil eder, yorgunluk ve/veya bellek. Bu tahlil de olmayan önyargılı analizi araba T hücreleri transcriptome, Proteom veya fosfor-Proteom21,26ve27klinik yanıt-e doğru tahmin etmek için kabul T hücre polyfunctionality ile birleştirmek uygundur. Ayrıca, tümör hücreleri de T hücre bağışıklık sitokin salgısının28gibi karşı adaptif onların yanıt için test edilebilir. Örnekleri birden fazla zaman noktalarda hasat bu tahlil statik, hem dinamik araba T hücre davranış analizi için de tümör hücrelerinin aşırı sayıda yanıtlarken sağlar.

Tahlil efektör kudret aynı antijen hedefleme araba T hücrelerinin ama farklı tasarımları ile karşılaştırma ve/veya üretim süreçleri içinde özellikle güçlü. Biz bu tahlil bu CD4 tanımlamak için kullandığınız+ araba T hücreleri CD8 daha üstün uzun vadeli efektör işlevi arabuluculuk başardık+ hücreleri21. Bu da içinde vivo o araba etkinliği sitotoksisite, daha sonra zaman puan (D5-D7) ile daha fazla tekrarlayan tümör meydan tüp bebek araba T hücre değerlendirme için kullanma gerekliliği vurgulayarak bu tahlil sırasında ilişkili gösterilmiştir. Her ne kadar GBM hücreleri hedef hücre burada örnek olarak kullanıldı, bu tahlil kolayca farklı T hücre-tümör birleşiminden kabul. Özellikle, araba T hücre davranış farklı antijen yoğunlukları ve hedeflenen antijenleri aracın üzerine araba tanıma29sıralı moleküler olayları araştırmak için sağlanan çeşitli düzeylerde ifade etmek için mühendislik kanser hücreleri üzerine de değişebilir. Bu nedenle, bu tahlil farklı hedeflere karşı bazı araba T hücreleri harekete geçirmek paterni incelemek için de yararlanılabilir.

Hedef hücre canlılığı ve araba T hücresi genişletmeye iki ayarlıyoruz dökümanları Bu testin olduğundan, tüm ortak kültürler ile uygun başlamak önemlidir (> % 70) tümör ve T hücreleri. Rechallenge işlemleri gerçekleştirirken, eylem alıyorum medya (Adım 5.3) tümör ve T hücrelerinin hücre sayımları gereksiz varyasyonları tanıtmak değil sırayla kuyu dibinde rahatsız. Bu tahlil süspansiyon hedef hücre hatları üzerinde gerçekleştirirken, bu kalan hücreleri hasat Santrifüjü tümör hücre rechallenge önce tarafından önerilir.

Bu testin bir sınırlama kurulum parametrelerini (ilk ortak kültür ve rechallenge E:T oranları) ihtiyacı düzeltilecek bağlı olarak farklı araba-tümör kombinasyonları var. Tümör hücreleri IMMUNO inhibitör molekülleri (örneğin PD-L1) önemli bir düzeyde ifade, örneğin, daha yüksek bir E:T oranı göz önüne alındığında genel önerilir verimliliği öldürme Engelli PD-L1-düşük tümör hücreleri ile karşılaştırıldığında. Yeni araba-tümör kombinasyonları için tahlil uygulamadan önce bir pilot çalışma en uygun koşulları belirlemek için genellikle en güçlü araba T hücreleri ortadan kaldırmak için tahlil test sağlayan önerilir > bitiş noktası, tümör hücrelerinin % 80’i. Eğer tümör hücreleri floresan etiketli doğrudan hücre-hücre iletişim T Hücre-aracılı araba öldürmek için gerekli olduğundan, sonra panelin akım sitometrik analizin buna göre ayarlanması gerekir (örneğin tümör hücreleri GFP etiketli, sonra herhangi bir FITC Birleşik olsaydı antikorlar kullanılmamalıdır).

B hücre maligniteler karşı araba T hücrelerinin klinik etkinliği iki FDA onaylı ilaçlar için açmıştır. Bununla birlikte, yanıtı hangi araba ürünleri30fenotipik özellikleri ile ilişkilendirmek için aydınlatılmamıştır farklı hastalar27,30,31, genelinde önemli değişim göstermektedir. Bu tüp bebek tekrarlayan tümör meydan tahlil daha işlevsel olarak araba efektör kudret fenotipik karakterizasyonu ve polyfunctionality sitokin üretim ek olarak test etmek için bir yaklaşım sağlar ve akışı sağlayarak daha yüksek tarama için izin verir Klinik ürünler akıllı sadakat korurken içinde vivo tümör modelleri ile karşılaştırıldığında. Genel olarak, bu tahlil T hücre fonksiyonel test araba T hücre tasarımı, önceden klinik ve klinik geliştirme için kullanılabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser California rejeneratif tıp (CIRM) hibe TR3-05641 ve Enstitüsü NIH hibe P30 CA33572 (çekirdek) gelen hibe tarafından desteklenmiştir. D.W. ncı bursu 1F99CA234923-01 tarafından desteklenir.

Materials

0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium Corning MT25051CI
1M Hepes Irvine Scientific 9319
200 mM L-Glutamine Cambrex Bio Science 17-605E
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) – FluoroPure grade Invitrogen D21490
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) Novartis Oncology NDC 0078-0495-61
Anti-CD137, PE BD Biosciences 555956 4B4-1
Anti-CD19, PE-Cy7 BD Biosciences 557835 SJ25C1
Anti-CD3, PERCP BD Biosciences 340663 SK7
Anti-CD4, FITC BD Biosciences 340133 SK3
Anti-CD45, PERCP BD Biosciences 340665 2D1
Anti-CD45RO, PE BD Biosciences 561137 UCHL1
Anti-CD62L, APC BD Biosciences 559772 DREG-56
Anti-CD69, APC BD Biosciences 340560 L78
Anti-CD8, APC-Cy7 BD Biosciences 348793 SK1
Anti-IL-13, PE BD Biosciences 340508 JES10-5A2
Anti-LAG-3, PE eBiosciences 12-2239-41 3DS223H
Anti-PD-1, APC-Cy7 BioLegend 329921 EH12.2H7
Anti-TIM-3, APC eBiosciences 17-3109-42 F38-2E2
B-27 Serum-Free Supplement (50X) Invitrogen 17504-044
Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) Corning Life Sciences 3596
Defined fetal bovine serum,HI IR Hyclone Labs SH30070.03IH
DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine MediaTech, Inc. 15-090-CV
DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L Invitrogen 11960051
DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES Fisher Scientific MT10092CV
HBSS Irvine Scientific 9224
Heat-Inactivated FCS Hyclone SH30070.03
Heparin Sodium(1,000 U/ml) American Pharmaceutical 401811B
MACSQuant Milteni Biotech Inc. BIS013220 
PBS 1X W/CA & MG Irvine Scientific 9236
PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) VWR Scientific Products PB15009A
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG-200
Recombinant human FGF R&D Systems 233-FB
rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) CellGenix, US Operations tF0297
Sodium Azide (NaN3) Sigma S8032
Sorvall ST40R Thermo Scientific 41693700
TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML  IRVINE SCIENTIFIC CORP 6472
Tecnol Procedure Mask Kimberly-Clark 47117
X-VIVO 15 Lonza BW04-744Q
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).
  3. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  4. Lee, D. W., et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).
  5. Yong, C. S. M., et al. CAR T-cell therapy of solid tumors. Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).
  6. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
  7. Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. Smart CARs engineered for cancer immunotherapy. Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).
  8. Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).
  9. Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials. Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).
  10. Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  11. Brown, C. E., et al. Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma. Molecular Therapy. , (2017).
  12. Long, A. H., et al. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).
  13. Cherkassky, L., et al. Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition. The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).
  14. Priceman, S. J., et al. Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer. Oncoimmunology. 7 (2), 1380764 (2018).
  15. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
  16. Gattinoni, L., et al. Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).
  17. Malandro, N., et al. Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion. Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).
  18. Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
  19. Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
  20. Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell. Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).
  21. Wang, D., et al. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), (2018).
  22. Kahlon, K. S., et al. Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells. Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).
  23. Brown, C. E., et al. Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells. Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).
  24. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  25. Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
  26. Salter, A. I., et al. Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function. Science Signaling. 11 (544), (2018).
  27. Rossi, J., et al. Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL. Blood. 132 (8), 804-814 (2018).
  28. Garcia-Diaz, A., et al. Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression. Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).
  29. Walker, A. J., et al. Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase. Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).
  30. Fraietta, J. A., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
  31. Fraietta, J. A., et al. Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells. Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).

Tags

In VitroTumor CellRechallengeChimeric Antigen ReceptorCAR T CellsAnti-tumor FunctionGlioblastomaTumorspheresCo-cultureHigh Throughput ScreeningCell DissociationCell SuspensionCell CultureSupernatantTrypsin EDTA

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, D., Starr, R., Alizadeh, D., Yang, X., Forman, S. J., Brown, C. E. In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function. J. Vis. Exp. (144), e59275, doi:10.3791/59275 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image