Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Tüm yöntem tanımlamak hayvan bakımı yönergeleri, University of North Carolina Chapel Hill uygun. 1. mikro-enjeksiyon pipetler hazırlanması Cam kılcal bir micropipette çektirmenin kullanarak çekin. Yapısal kirleri yoksun son derece keskin bir yüzey sağlar gibi bazı enjeksiyonlar için iğne eğim önerilir. Bunu yapmak için 15−20 min için 45 ° açılı beveling direksiyona iğne çekti sonuna Lehçe.Not: çekmek için tam ayarları kullanılan çektirme göre değişir. Eğimin son iç çapını 20−40 µm arasında olmalıdır. Silikon ile kılcal cam iç ve dış yüzeylerin kat. İlk siliconizing Agent’taki iğne ve sonra backload siliconizing Ajan çözüm iç yüzeyi kat için her micropipette içine dış yüzeyinin kat için iğne batır.Not: Kaplama cam kapiller 24 h implantasyon deneme önce yapılmalıdır. Cam kılcal silikon ile kaplama cama kimyasal olarak inert bir yüzey sağlar. Kılcal bırakılırsa tedavi edilmezse, sonraki adımda oluşturulan hücre süspansiyon uygun cam ve iğne takın. Bu nedenle, kaplama gerekli ve yöntemin başarısı için çok önemli.Dikkat: Siliconizing aracı hazır piyasada bulunan heptane ve 1,7-dichloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Malzeme tablo) karışımıdır. Bu son derece yanıcı ve akut toksik olduğunu. Her zaman bir duman başlık içinde uygun KKE ele. Backload iğne için yük ~ 5−10 µL bir mikro-enjeksiyon pipet ucu (Tablo reçetesi) içine siliconizing Aracısı. Mikro-enjeksiyon ipucu çekti cam geniş sonuna kapiller yerleştirmek ve ucu kadar aşağı (yakın cam iğne ucu) mümkün olduğunca konumlandırın. Siliconizing aracı iğne hava kabarcıkları en aza indirmek için yavaş yavaş yükleme pipet kaldırılırken çıkarma. Cam iğne 10 dakika içinde siliconizing Ajan bırakın, yeni bir yükleme pipet ile alıyorum tarafından kaldırmak ve iğneler gecede bir duman mahallede kuru izin. Deneme, sabah cam kılcal aşağıdaki yordamı adım 1.2 deiyonize suyla durulayın ve 3−4 h için kurumasını sağlar. 2. çözümler hazırlanması 5 mL 4,2 mL Dulbecco’nın değiştirilmiş kartal orta ve Ham’ın besin karışımı F12 (DMEM/F12) 750 µL, Fetal sığır Serum (FBS) ve penisilin/streptomisin 50 µL ilave tarafından çözüm nötralize tripsin de hazırlayın. 37 ° C’de kullanmak kadar saklamak. 5 hazırlamak Hank’in 995 µL boya (içinde dimetil sülfoksit [DMSO], Malzemeler tablo) etiketleme 1 mM stokunun pipetting 5 µL tarafından boya çözüm etiketleme µM dengeli tuz solüsyonu (HBSS). 1 dk ve mağaza kullanımı kadar 37 ° C’de için girdap. Taze paraformaldehyde (PFA) 10 mL % 32 İngiltere’de yılın stok çözeltisi 62 mL moleküler biyoloji sınıf su ve Dulbecco’nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) x 10 8 mL ile birleştirerek hazırlayın. Son konsantrasyonu % 4 olduğunu İngiltere’de yılın 1 x DPBS içinde. 3. ana bilgisayar embriyo hazırlanması 38 ° C kadar Hamburger ve Hamilton (HH) sahne 1910oksijen bir kuluçka yatay yönde verimli tavuk yumurtası kuluçkaya.Not: manipülasyon için seçilen sahne esnek ve her bireysel deney amacı tamamen bağımlı değil. Küçük bir delik yapmak için açılı forseps kullanarak yumurta Ekvatordaki yumurta kabuğu “düz” sonu puan edinildi > 1 mm çapında. Bir 18 G iğne ponksiyon yoluyla ekli 10 mL şırınga ekleyebilir veya albümin ~ 5 mL kaldırabilir.Not: Bu anatomik konum “hava hücre” yumurta içinde dışında ve albümin ponksiyon yapıldıktan sonra sızıntı tutar. “Embriyo yumurta kabuğu, sonraki adımda potansiyel hasar önleme uzak damla olarak” Bu adım önerilir. Saydam bandı yumurta kabuğu uygulamak. Açılı forseps ile puan ve eğri tenotomy makas kullanarak bir ~2.5 cm pencere kesmek. İncelemek ve Hamburger ve Hamilton10 tarafından belirlenen ölçütlere göre embriyo sahne ve ponksiyon adım 3.2 şeffaf bant ile mühür.Not: Burada, 37−40 somites uzanan kuyruk tomurcuk haline sahip sahne HH 19 embriyo kullanılmıştır. Pencerenin yumurta (adım 3.3) üst kısmında açıldıktan sonra delik kadar kapalı olmalıdır değil. ~ 200 µL ekli 1 mL şırınga ile 32 G iğne kullanarak embriyo altında (1:5) çini mürekkebi/HBSS karışımı enjekte.Not: çini mürekkebi embriyo ve sarısı altında arasındaki görsel kontrast sağlar. Alternatif tarafsız kırmızı veya piyasada bulunan Camgöbeği floresan gibi protein (CFP) boya veya mavi flüoresan protein (BFP) Floresan filtre setleri karşıtlığı artırmak için kullanılabilir. HBSS 1 mL dropwise embriyonik diskin üzerine ekleyin ve parafin film ile pencereli kabukları mühür. Yumurta enjeksiyon için hazır kadar geri oksijen kuluçka makinesine koyun. 4. yalıtım donör doku Donör verimli tavuk yumurta 38 ° c oksijen bir kuluçka sahne HH 19 (veya istediğiniz sahne) kadar kuluçkaya. Embriyonun yumurtadan kaldırmak ve steril HBSS oda sıcaklığında (RT) içeren 100 mm x 15 mm petri kabına yerleştirin. Cerrahi olarak microdissect atriyal donör dokudan ilk embriyo tüm embriyonik kalp yalıtma ve sonra kalp kulakçık izole ederek forseps, tenotomy makas ve microspatula bir stereo diseksiyon mikroskop altında kullanarak her embriyo. HBSS buz üzerinde 1 mL içeren bir steril 1.5 mL microcentrifuge tüp havuzda. Bir kez toplanan tüm donör doku doku tarafından Santrifüjü 1000 x g sabit açılı microcentrifuge 4 ° C’de 5 min için de cips. 5. tripsin sindirim donör doku Hücre topakları 1 mL prewarmed % 0.05 tripsin-EDTA resuspend ve sallayarak ısı taşını 300 devirde 15 dakika 37 ° C’de kuluçkaya. Alternatif olarak, bir su banyosu örnek periyodik ajitasyon ile kullanın. Yukarı ve aşağı kalan herhangi bir doku kırmaya ve adım 4.4 olduğu gibi cips sindirim çözüm pipette. Pelet çözüm ve santrifüj olduğu gibi adım 4.4 nötralize tripsin 1 ml resuspend. Kırmızı floresan boya çözüm etiketleme 400 µL hücrelerde resuspend ve 37 ° c ısı blok içinde 20 dk için kuluçkaya. Alternatif olarak, bir su banyosu kullanın. Etiketleme reaksiyon tamamlandıktan sonra hücre adım 4.4 olduğu gibi cips ve 1 mL HBSS (sayı 1 ile 3 adımları değiştirilebilir yıkama) ile yıkayın. ~ 50.000 hücreleri/hangi genel olarak 5−10 µL çalışma birimdeki bağlı olarak toplam hücre verim sonuçları µL, konsantrasyon, etiketli, pelleted hücreleri resuspend.Not: Hücre konsantrasyonları aşağıda ~ 50.000 hücre/µL zavallı enjeksiyon verimliliği neden olabilir. 6. In-vivo enjeksiyon Backload hücre süspansiyon içine adım 1.2 prosedürleri aşağıdaki silikon tedavi cam kılcal bir pipet. Pipet basınç microinjector aparatı monte. Ana bilgisayar embriyo oksijen kuluçka çıkarın ve bir yumurta tutucu floresan stereo diseksiyon mikroskop altında yerleştirin. Vitelline membran steril iyi forseps kullanarak açın ve küçük bir insizyon attım (~0.5−1.0 mm uzunluğunda) kalp zarını içinde olun. Ek işleme/diseksiyon bağlı olarak hedef bölge enjeksiyon için gerekli olabilir. Öyle ki hedef doku mikroenjeksiyon iğne ucu nüfuz microinjector getirin. Basınç hücreleri enjekte ve floresan etiket implante hücreleri istenen dokuda mevcut olduğunu belirlemek için kullanın. Tipik enjeksiyonlar için 0,5’den küçük tek darbeleri uygulamak basınç 100-400 hectopascals arasında değişen süre s.Not: Pulse uzunluğu ve mutlak basınç enjekte edilir hücre sayısına bağlı olarak değişir ve bireysel ihtiyaçlarına uygun şekilde değiştirilebilir. Microinjector aparatı geri çekmek ve basınç enjekte sonra sahibinden yumurta kaldırın. 1 mL sıcak HBSS dropwise embriyo ekleyin, şeffaf ambalaj bant kullanarak yumurta mühür ve 24 h posta implantasyon için 38 ° C’de kuluçka oksijen kuluçkaya. 7. izolasyon ve analiz RT HBSS forseps, tenotomy makas ve microspatula 4.3 adıma benzer kullanarak ana bilgisayar embriyolar izole ve %4 PFA gecede 4 ° c hafif sallanan ile düzeltin. Embriyo 3 x 5 dk HBSS RT, hafif sallanan ile yıkayın ve daha fazla aşağı akım analiz (mikroskopi, immünhistokimya, in-situ hibridizasyon, vb) 4 ° C’de HBSS içinde saklayın.