Микроинъекции системы в Vivo имплантации эмбриона кардиомиоцитов птичьего эмбриона

Все методы, описанные соблюдать руководящие принципы ухода за животными в Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл. 1. Подготовка микро инъекции пипетки Вытяните стеклянных капилляров с помощью микропипеткой съемник. Для некоторых инъекции игла фаски рекомендуется как она обеспечивает чрезвычайно острые поверхности лишено структурных примесей. Для этого, польский конце вытащил иголку на колесо фаски под углом 45 ° для 15−20 минут.Примечание: Точные настройки для буксировки будет меняться в зависимости от съемник используется. Последний внутренний диаметр скоса должна быть между 20−40 мкм. Герб внутренних и внешних поверхностей стеклянный капилляр с силиконом. Сначала опустите иглы в siliconizing агент для покрытия внешней поверхности иглы, а затем валидатор siliconizing агент решения в каждом микропипеткой для покрытия внутренней поверхности.Примечание: Покрытие стеклянных капилляров должно быть сделано 24 ч до имплантации эксперимент. Покрытие стекла капилляров с силиконовой обеспечивает химически инертный поверхности стекла. Если остаются капилляров необработанной, суспензию клеток, образующихся в последующих шагах будет придерживаться стекла и вставьте иглу. Таким образом покрытие является необходимым и жизненно важным для успеха метода.Предупреждение: Siliconizing агент является смесью коммерчески доступных готовых гептана и 1,7-дихлор-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Таблица материалов). Это чрезвычайно легковоспламеняющиеся и острой токсичностью. Всегда обращаться с надлежащей СИЗ внутри зонта. На тыльной стороне иглы, нагрузка ~ 5−10 мкл siliconizing агента в кончика пипетки микро инъекции (Таблица материалов). Место кончике микро инъекции в широкий конец вытащил стекла капилляров и Расположите наконечник как далеко вниз как можно скорее (недалеко от кончик иглы стекла). Удаляя медленно загрузки дозаторов для того, чтобы свести к минимуму пузырьков воздуха в иглу извлечь siliconizing агент. Оставить siliconizing агента в стеклянных иглу за 10 мин, удалить, аспирационных с новой загрузки дозаторов и позволяют иглы высохнуть на ночь в зонта. Утром эксперимента, промойте деионизованной воды после процедуры на шаге 1.2 стеклянные капилляры и дайте высохнуть на 3−4 h. 2. Приготовление растворов Подготовьте 5 мл трипсина, нейтрализуя решение путем дополнения 4.2 мл Дульбекко изменение орла средних и ветчиной в питательной смеси F12 (DMEM/F12) с 750 мкл плода Bovine сыворотки (ФБС) и 50 мкл пенициллина/стрептомицина. Хранить при 37 ° C до использования. Подготовить 5 мкм, маркировки раствор красителя, дозирования 5 мкл акций 1 мм, маркировки краситель (в диметилсульфоксида [ДМСО], Таблица материалов) в 995 мкл Хэнка сбалансированного солевого раствора (HBSS). Вихрь за 1 мин и хранить при 37 ° C до использования. Подготовьте свежие параформальдегида (PFA) путем объединения 10 мл 32% PFA Стоковый раствор с 62 мл воды молекулярной биологии класса и 8 мл 10 x Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS). Конечная концентрация составляет 4% ПФА в 1 x DPBS. 3. Подготовка принимающей эмбрионов Инкубируйте плодородные куриные яйца в горизонтальной ориентации в увлажненные инкубатор 38 ° C до гамбургеров и Гамильтон (HH) этап 1910.Примечание: Этап, выбрали для манипуляции является гибкой и полностью зависит от цели каждого индивидуального эксперимента. Оценка «плоского» конец яичной скорлупы вдоль экватора яйцо с помощью угловой щипцы сделать небольшой прокол > 1 мм в диаметре. Вставьте иглу 18 G с прилагаемой 10 мл шприц через прокол и удалить ~ 5 мл альбумина.Примечание: Это анатомическое расположение является внешним по отношению к «воздушные ячейки» внутри яйца и предотвращает утечки после пункции альбумина. Этот шаг рекомендуется как он «падает» эмбриона от яичной скорлупы, предотвращая потенциальный ущерб в последующих шагах. Применить прозрачную ленту к верхней части скорлупы яиц. Оценка угловой пинцетом и прорубил окно ~2.5 см ножницами изогнутые тенотомия. Инспектировать и стадии эмбриона, основанные на критериях, установленных гамбургер и Гамильтон10 и герметизации проколов на шаге 3.2 с прозрачной лентой.Примечание: Здесь, этап HH 19 эмбрионов используются, которые имеют 37−40 сегменты в зародыше хвост. Прокол не должны быть закрыты до, после открытия окна в верхней части яйцо (шаг 3.3). Придать ~ 200 мкл чернил Индии/HBSS смесь (1:5) под эмбрионов, с помощью иглы 32 G с прилагаемой 1 мл шприц.Примечание: чернила Индии обеспечивает визуальный контраст между зародышем и желток под. Альтернативные краски как нейтрального красного или коммерчески доступных голубой флуоресцентный белок (СЛП) или наборы фильтров флуоресценции синий флуоресцентный белок (БПС) может использоваться для улучшения контрастности. Добавьте 1 mL HBSS каплям на эмбриональных диск и уплотнение оконных снаряды с парафином фильм. Поместите яйца обратно в увлажненные инкубаторе до готовности для инъекций. 4. изоляция донорской ткани Инкубируйте доноров плодородные куриные яйца в увлажненные инкубатора в 38 ° C до стадии HH 19 (или нужный этап). Удаление эмбриона из яйца и место в чашке Петри 100 мм х 15 мм, содержащие стерильные HBSS при комнатной температуре (RT). Хирургическим microdissect предсердий доноров ткани от каждого эмбриона сначала изоляции всей эмбриональных сердце из эмбриона и затем изолируя предсердий сердца с помощью щипцов, тенотомия ножницы и microspatula под стерео, рассекает микроскопом. Бассейн в стерильных 1,5 мл microcentrifuge тубы с 1 мл раствора HBSS на льду. После того, как были собраны все донорской ткани, окатышей ткани центрифугированием на 1000 x g 5 минут при температуре 4 ° C в фиксированный угол microcentrifuge. 5. Пищеварение трипсина доноров ткани Ресуспензируйте гранулы клеток в 1 мл подогретую трипсина 0,05%-ЭДТА и инкубировать при 37 ° C 15 мин в блоке пожимая тепла в 300 об/мин. Кроме того используете на водяной бане с периодическим перемешиванием образца. Пипетка пищеварение решение вверх и вниз, чтобы разрушить любые оставшиеся ткани и Пелле как в шаге 4.4. Ресуспензируйте гранулы в 1 мл трипсина, нейтрализации раствора и центрифуги как в шаге 4.4. Ресуспензируйте клетки в 400 мкл красный люминесцентные маркировки раствор красителя и инкубировать при 37 ° C 20 мин в блоке тепла. Кроме того используете на водяной бане. По окончании обозначая реакции Пелле клетки как в шаге 4.4 и мыть с 1 мл раствора HBSS (количество мыть шаги может изменяться от 1 до 3). Ресуспензируйте Приклеенные этикетку, гранулированных клетки в концентрации ~ 50 000 клеток/мкл, что обычно приводит к 5−10 мкл рабочего объема в зависимости от урожайности ячейке.Примечание: Концентрации клеток ниже ~ 50 000 клеток/мкл может привести к плохой инъекции эффективности. 6. в vivo инъекций Валидатор банкнот BackLoad суспензию клеток в Силиконовой обработанного стекла капиллярные пипетки после процедур, описанных в шаге 1.2. Смонтируйте пипеткой в аппарате microinjector давления. Снять хост эмбрионов увлажненные инкубатора и место в яйцо держатель под люминесцентные стерео, рассекает микроскопом. Открыть vitelline мембраны, с использованием стерильных тонкой щипцами и сделать небольшой надрез (~0.5−1.0 мм в длину) в перикарда. Дополнительные манипуляции/диссекции может быть необходимо в зависимости от целевого региона для инъекций. Позиция microinjector, таким образом, чтобы кончик иглы микроинъекции проникает в ткани-мишени. Давление вставки ячейки и использовать флуоресцентные метки, чтобы определить, что имплантированные клетки присутствуют в желаемой ткани. Для типичных инъекции, применять единый импульсов меньше, чем 0,5 s в срок, начиная от 100-400 hectopascals давления.Примечание: Длительность импульса и абсолютное давление будет варьироваться в зависимости от количество клеток для инъекций и могут быть изменены с учетом индивидуальных потребностей. Убрать аппарат microinjector и удалите яйцо из держателя после инъекции давление. Добавьте 1 mL теплого HBSS каплям на эмбрион, печать с использованием прозрачной упаковочной ленты яйца и инкубировать в увлажненные инкубатора в 38 ° C для имплантации пост 24 h. 7. изоляция и анализ Изолировать хост эмбрионов в HBSS RT, используя пинцет, тенотомия ножницы и microspatula похоже на шаг 4.3 и исправить в 4%, PFA на ночь при 4 ° C с плавное покачивание. Промыть плавное покачивание эмбрионы 3 x 5 мин, в HBSS на RT и хранить в HBSS на 4 ° C для дальнейшего течению анализа (микроскопия, иммуногистохимия, гибридизации in situ и т.д.).