Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Todos os métodos descritos seguem diretrizes de cuidados com animais de The University of North Carolina em Chapel Hill. 1. preparação da microinjecção pipetas Puxe os capilares de vidro usando um extrator da micropipeta. Para algumas injeções, bisel da agulha é recomendada pois fornece uma superfície extremamente afiada desprovida de impurezas estruturais. Para fazer isso, polir o fim de uma agulha puxada em uma roda de chanfradura em um ângulo de 45° para min 15−20.Nota: As configurações exatas para puxar irão variar com base no extrator sendo usado. O diâmetro interno final do bisel deve estar entre 20−40 µm. Revesti as superfícies internas e externas do vidro capilar com silicone. Primeiro Mergulhe as agulhas no agente siliconizing para revestir a superfície externa da agulha e depois carregue a solução de agente siliconizing em cada micropipeta para revestir a superfície interna.Nota: O revestimento dos capilares de vidro deve ser feito 24 h antes da experiência de implantação. Revestimento dos capilares de vidro com silicone fornece uma superfície quimicamente inerte ao vidro. Se os capilares são deixados sem tratamento, a suspensão de células gerada em etapas posteriores irá aderir ao vidro e conecte a agulha. Portanto, o revestimento é necessário e vital para o sucesso do método.Atenção: O agente siliconizing é uma mistura de comercialmente disponível ready-made de heptano e 1,7-dicloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Tabela de materiais). É extremamente inflamável e agudamente tóxicos. Sempre manuseie com EPI adequado dentro de uma coifa. Para Retrocarregue a agulha, carregar ~ 5−10 µ l do agente siliconizing em uma ponta da pipeta de injeção de micro (Tabela de materiais). Colocar a ponta da microinjecção no final de largura do vidro puxado capilar e posicione a ponta, tanto para baixo quanto possível (perto da ponta da agulha de vidro). Ejete o agente siliconizing enquanto lentamente, retirar a pipeta de carregamento a fim de minimizar as bolhas de ar na agulha. Deixar o agente siliconizing com a agulha de vidro para 10 min, retire por aspiração com uma pipeta de carregamento novo e permitir agulhas secar durante a noite em uma coifa. A manhã do experimento, enxagúe os capilares de vidro com água desionizada, seguindo o procedimento na etapa 1.2 e deixar para secar durante 3−4 h. 2. preparação de soluções Prepare-se 5 mL de tripsina neutralizando a solução completando 4,2 mL do médio modificados da águia de Dulbecco e nutriente mistura do Ham F12 (DMEM/F12) com 750 µ l de soro bovino Fetal (FBS) e 50 µ l de penicilina/estreptomicina. Armazenar a 37 ° C até o uso. Prepare-se 5 µM rotulagem solução corante por pipetagem 5 µ l de estoque de 1 mM rotulagem corante (em Dimetilsulfóxido [DMSO], Tabela de materiais) em 995 µ l de Hank está equilibrada solução salina (HBSS). Vórtice por 1 min e loja a 37 ° C até o uso. Prepare-se fresco paraformaldeído (PFA) combinando-se 10 mL da solução-mãe de PFA 32% com 62 mL de água de grau de biologia molecular e 8 mL de 10 x fosfato salino de Dulbecco (DPBS). A concentração final é 4% PFA em 1 x DPBS. 3. preparação dos embriões de acolhimento Incube ovos férteis de galinha em uma orientação horizontal em uma incubadora umidificada em 38 ° C até Hamburger e Hamilton (HH) estágio 1910.Nota: O palco escolhido para manipulação é flexível e inteiramente dependente dos objectivos de cada experiência individual. Marcar a extremidade “achatada” da casca do ovo ao longo do Equador do ovo usando fórceps angulado para fazer uma pequena punção > 1 mm de diâmetro. Inserir uma agulha de 18 G com seringa de 10ml anexado através da punção e remover ~ 5 mL de albumina.Nota: Esta localização anatômica é externa à célula de”ar” dentro do ovo e mantém a albumina vazem uma vez feita a punção. Esta etapa é recomendada, pois ela “desce” o embrião longe a casca do ovo, evitando possíveis danos nas etapas subsequentes. Aplique a fita transparente para o topo da casca do ovo. Marcar com pinça angular e cortar uma janela de ~2.5 cm com uma tesoura curva para tenotomia. Inspecionar e estágio do embrião com base em critérios estabelecidos pela Hamburger e Hamilton10 e selar a punção da etapa 3.2 com fita transparente.Nota: Aqui, embriões de etapa 19 HH são usados que têm 37−40 somitas estendendo-se para o broto de cauda. A punção não deve ser selada até depois que a janela é aberta na parte superior do ovo (passo 3.3). Injete ~ 200 µ l de mistura de tinta nanquim/HBSS (1:5) sob o embrião usando uma agulha 32G com seringa de 1ml anexado.Nota: tinta nanquim fornece contraste visual entre o embrião e a gema abaixo. Alternativa de corantes como neutra comercialmente disponível ou vermelha ciana proteína fluorescente (PCP) ou conjuntos de filtros de fluorescência azul proteína fluorescente (BFP) podem ser usados para melhorar o contraste. Adicionar 1 mL de HBSS, gota a gota no disco embrionário e selar conchas em janelas com película de parafina. Coloque os ovos em incubadora umidificada até que esteja pronto para a injeção. 4. isolamento do tecido do doador Incube a doadora de óvulos férteis de galinha numa incubadora umidificado a 38 ° C até 19 HH de fase (ou estágio desejado). Remover o embrião do ovo e coloque em um prato de petri 100 x 15 mm contendo HBSS estéril à temperatura ambiente (RT). Cirurgicamente microdissect tecido atrial doador de cada embrião primeiro isolar todo o coração embrionário do embrião e isolando-se dos átrios do coração usando pinça, tesoura tenotomia e microspatula sob um estéreo microscópio de dissecção. Piscina em um tubo de microcentrifugadora mL 1,5 estéril contendo 1 mL de HBSS no gelo. Uma vez que todo o tecido doador tenha sido coletado, pelota o tecido por centrifugação a 1000 x g por 5 min a 4 ° C, em uma ângulo fixo microcentrifuga. 5. digestão de tripsina do tecido do doador Resuspenda pelotas de células em 1 mL de escaldadas 0.05% do trypsin-EDTA e incubar a 37 ° C por 15 min em um bloco de calor tremendo a 300 rpm. Como alternativa, use um banho de água com agitação periódica da amostra. Adicionar a solução de digestão acima e para baixo para quebrar qualquer tecido restante e pelota como na etapa 4.4. Resuspenda o pellet em 1 mL de neutralizar a solução e centrifugar como na etapa 4.4 a tripsina. Ressuspender as células em 400 µ l de vermelho fluorescente, rotulando a solução corante e incubar a 37 ° C por 20 min em um bloco de calor. Como alternativa, use um banho de água. Finalizada a reação de rotulagem, as células como na etapa 4.4 de pelotas e lavar com 1 mL de HBSS (número de lavagem etapas podem ser variadas entre 1 e 3). Ressuspender as células em uma concentração de ~ 50.000 células / µ l, que geralmente resulta em um volume de trabalho 5−10 µ l dependendo do rendimento total da célula rotuladas, peletizadas.Nota: Concentrações de célula abaixo ~ 50.000 células / µ l podem resultar em eficiência de injeção pobre. 6. in vivo injeção Carregue a suspensão de células para uma pipeta capilar de silicone vidro Tratado seguindo os procedimentos na etapa 1.2. Monte a pipeta no aparelho de microinjector de pressão. Retirar embriões de anfitrião da incubadora umidificada e coloque em um suporte de ovo debaixo o fluorescente estéreo microscópio de dissecção. Abrir a membrana vitelínico usando pinça fina estéril e faça uma pequena incisão (~0.5−1.0 mm de comprimento) no pericárdio. Manipulação/dissecação adicional podem ser necessários dependendo da região de destino para a injeção. Posicione o microinjector tal que a ponta da agulha microinjeção penetra o tecido-alvo. Pressão injetar células e usar a etiqueta fluorescente para determinar que as células implantadas estão presentes no tecido desejado. Para injeções típicas, aplicam-se pulsos único a menos de 0,5 s em duração variando de 100-400 hectopascals na pressão.Nota: Duração de pulso e pressão absoluta irão variar dependendo do número de células a ser injetado e podem ser modificados para atender necessidades individuais. Retrair o aparelho microinjector e remova o ovo do suporte após injeção de pressão. Adicionar 1 mL de HBSS quente gota a gota até o embrião, selar ovos usando fita de embalagem transparente e incubar na incubadora umidificada a 38 ° C para implantação do posto de 24h. 7. isolamento e análise Isolar os embriões de anfitrião em RT HBSS usando a pinça, tesoura tenotomia e microspatula semelhante ao passo 4.3 e corrigir em 4% PFA overnight a 4 ° C, com balanço suave. Lavar 3 x 5 min de embriões em HBSS em RT com balanço suave e armazene em HBSS a 4 ° C para uma análise mais adicional a jusante (microscopia, imuno-histoquímica, hibridização in situ, etc.).