鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

記載されているすべてのメソッドは、動物のケアのガイドラインのノースカロライナ大学チャペルヒル校に従います。 1. マイクロ インジェクション ピペットの準備 マイクロ ピペットの引き手を使用してガラス管を引き出します。いくつかの注射のため不純物の構造に欠けている非常にシャープな表面を提供するので針に斜角はお勧めします。これを行うには、ポーランドの 15−20 分の 45 ° の角度で面取りホイールに引っ張られた針の終了を実行します。注: を引っ張るための正確な設定が使用されている引き手に基づいて異なります。ベベルの最終の内径は、20−40 μ m の間でなければなりません。 シリコーン ガラスキャピラリの内部および外部の表面をコートします。まず針し内面塗装、各ピペットに backload 反応のエージェント ソリューションの外部の表面をコートする反応剤で針を浸しなさい。注: コーティング ガラス管の注入実験の前に 24 時間を行う必要があります。シリコーンとガラス管をコーティング ガラスに化学的に不活性な表面を提供します。毛細血管が残っている場合、未処理細胞懸濁液の後の手順で生成されたガラスに付着、針を差し込みます。したがって、コーティングは必要とメソッドの成功に不可欠です。注意: 反応のエージェントは、ヘプタンと 1, 7-ジクロロ-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (材料表) の既製市販の混合物です。非常に可燃性、急性毒性です。常に適切な PPE ヒューム フードの中で処理します。 Backload 針、ロード ~ マイクロインジェクション ピペット チップ (材料表) に反応剤の 5−10 μ L。マイクロ射出成形の先端をキャピラリー引っ張られたガラスのワイド端で配置し、(ガラス針の先端) に近い可能な限りダウン限り先端の位置します。針で気泡を最小限に抑えるため読み込みピペットをゆっくりと除去しながら反応剤を取り出します。 10 分間ガラス針で反応剤を残す新しい読み込みピペットで吸引によって削除し、針は発煙のフードで一晩乾燥を許可します。 実験の朝は 1.2 のステップの手順に従って脱イオン水でガラス管をすすいで 3−4 h 間乾かします。 2. 溶液の調製 4.2 mL ダルベッコ変法イーグル培地とハムの栄養混合物 F12 (DMEM/F12) 750 μ L の胎仔ウシ血清 (FBS) とペニシリン/ストレプトマイシンの 50 μ L を補うことでソリューションを中和トリプシンの 5 mL を準備します。使用するまで 37 ° C で保存します。 準備 5 μ M にハンクの 995 μ (ジメチルスルホキシド [DMSO]テーブルの材料) で色素をラベル付け 1 mM 在庫の 5 μ L 分注による色素溶液をラベリング平衡塩類溶液 (HBSS)。1 分と使用までの 37 ° C でストアの渦。 62 ml 分子生物学グレード水・ ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) x 10 の 8 mL 32 %pfa 原液 10 mL を組み合わせることにより新しいパラホルムアルデヒド (PFA) を準備します。最終濃度は 4% PFA 1 x DPBS で。 3. 宿主胚の作製 38 ° C までハンバーガーとハミルトン (HH) ステージ 1910加湿のインキュベーターで水平方向に肥沃な鶏の卵を孵化させなさい。注: 選択操作の段階は柔軟性があり、それぞれの個々 の実験の目的に全く依存しています。 「フラット」鉗子を使用して小さなパンクにする卵の赤道に沿って卵の殻末のスコア > 直径 1 mm。穴を通して接続されている 10 mL 注射器、18 G 針を挿入し、アルブミンの ~ 5 mL を削除します。注: この解剖学的位置は卵の中の「空気電池」の外部にある、アルブミンが漏れ一度穿刺が行われるを防ぎます。以降の手順で潜在的な損傷を防ぐため、卵の殻から胚を「ドロップ」とは、この手順をお勧めします。 卵の殻の上に透明テープを適用します。鉗子とスコアし、湾曲した腱のはさみを使って ~2.5 cm ウィンドウをカットします。 検査しハンバーガーとハミルトン10によって確立された基準に基づく胚のステージし、透明テープでステップ 3.2 から穿刺をシールします。注: ここでは、HH 19 段階の胚は使用される尾芽に拡張する 37−40 の体節があります。卵 (ステップ 3.3) の上部にあるウィンドウを開いた後、まで穿刺を密封しないべきであります。 添付 1 mL 注射器 32 G の針を用いて胚の下にインドのインク/HBSS 混合物 (1:5) の ~ 200 μ L を注入します。注: インドのインクは、胚と下に卵黄と視覚的なコントラストを提供します。中立または市販の赤シアンの蛍光蛋白質 (CFP) など代替染料またはコントラストを改善するために青い蛍光タンパク質 (BFP) 蛍光フィルタ セットを使用ことができます。 胚ディスク上に滴下 HBSS の 1 mL を追加し、ウィンドウ シェル パラフィン フィルムをシールします。注射の準備ができるまで、加湿のインキュベーターに卵を配置します。 4. ドナー組織の分離 ステージ HH 19 (または必要な段階) までの 38 ° C で加湿のインキュベーターでドナー肥沃な鶏の卵を孵化させなさい。 卵から胚を取り出し、室温 (RT) で滅菌 HBSS を含む 100 mm × 15 mm のペトリ皿に置きます。 まず胚から胚心臓全体を分離し、心の底から心房を分離することによってステレオの解剖顕微鏡の下で microspatula、腱はさみ鉗子を使用してそれぞれの胚から、心房ドナー組織を外科的 microdissect。氷上 HBSS の 1 mL を含む滅菌 1.5 mL 遠心チューブにプール。 すべてのドナー組織が収集されると、組織の固定角度遠心機で 4 ° C で 5 分間 1000 × gで遠心分離によってペレットします。 5 ドナー組織のトリプシンの消化力 Prewarmed 0.05% トリプシン-EDTA の 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します、300 rpm での振動熱ブロックで 15 分の 37 ° C で孵化させなさい。また、サンプルの定期的な撹拌で水浴を使用します。 残りの任意の組織を分割し、ステップ 4.4 のようにペレットを上下に分解酵素液をピペットします。 ソリューションとステップ 4.4 のように遠心分離機を中和トリプシンの 1 mL にペレットを再懸濁します。 赤蛍光色素溶液を標識の 400 μ L で細胞を再懸濁します、ヒート ブロックの 20 分の 37 ° C で孵化させなさい。また、水浴を使用します。 ラベリングの反応が完了すると、ステップ 4.4 のように細胞をペレットし、HBSS (手順 1 と 3 の間に変えることができる洗浄の数) 1 mL で洗います。 ~ 50,000 細胞/μ L、一般的に総細胞収量によって 5−10 μ L 作業量の結果の濃度のラベルが付いた、小球形にされた細胞を再懸濁します。注: ~ 50,000 細胞/μ L 以下の細胞濃度は貧しい注入効率につながります。 6. 体内注入 手順手順 1.2 にシリコーン扱われたガラス毛細管ピペットに細胞懸濁液を backload。圧マイクロインジェクター装置にピペットをマウントします。 加湿インキュベーターから宿主胚を取り外し、解剖顕微鏡蛍光ステレオの下に卵ホルダーに入れます。 滅菌微細鉗子による卵黄膜を開き、心膜に小切開 (長さ ~0.5−1.0 mm) を加えます。注入の対象地域によって追加操作/郭清は必要かもしれない。 ガラスシリンジ マイクロインジェクション針の先端を貫通標的組織に移動します。 圧力細胞を注入し、蛍光ラベルを使用し、移植細胞が必要な組織に存在します。典型的な注射用 0.5 未満の単一パルスを適用圧力の 100-400 ヘクト パスカルに至る期間で s。注: パルス長および絶対圧注入する細胞の数によって異なりますが、個々 のニーズに合わせて変更することができます。 マイクロインジェクター装置を撤回し、圧力を注射した後、ホルダーから卵を削除します。 胚に暖かい HBSS の 1 mL を滴下追加、透明梱包用テープを使用して卵をシール、24 h のポスト注入の 38 ° C で加湿のインキュベーターで孵化させなさい。 7. 単離と解析 Microspatula 4.3, 手順と同様に、腱はさみ鉗子を使用して RT HBSS の宿主胚を特定し、4 %pfa は、穏やかな揺動 4 ° C で一晩で解決。 穏やかなロッキング常温 HBSS で胚 3 x 5 分を洗って、HBSS でさらに下流解析 (顕微鏡観察、免疫組織化学の現場の交配等) のための 4 ° C に保存します。