Sistema basato su microiniezione per In Vivo l'impianto di cardiomiociti embrionali nell'embrione aviaria

Tutti i metodi descritti aderiscano alle linee guida di cura degli animali di The University of North Carolina a Chapel Hill. 1. preparazione delle pipette micro-iniezione Tirare tubi capillari in vetro utilizzando un estrattore micropipetta. Per alcune iniezioni, smussatura dell’ago è consigliabile poichè fornisce una superficie estremamente nitida prive di impurità strutturali. Per effettuare questa operazione, polacco alla fine di un ago tirato su una ruota smussatura inclinata di 45° per 15 − 20 min.Nota: Le impostazioni esatte per la trazione variano in base sulla levetta di regolazione viene utilizzato. Il diametro interno finale della smussatura dovrebbe essere tra 20−40 µm. Ricoprire le superfici interne ed esterne del vetro capillare con silicone. Prima di immergere gli aghi nell’agente di siliconatura per rivestire la superficie esterna dell’ago e poi inserire la siliconatura soluzione agente in ogni micropipetta per rivestire la superficie interna.Nota: Il rivestimento dei vasi capillari di vetro dovrebbe essere fatto 24 h prima dell’esperimento di impianto. I capillari di vetro con del silicone del rivestimento fornisce una superficie chimicamente inerte al vetro. Se i capillari sono lasciati non trattati, la sospensione cellulare generata nei passaggi successivi verrà aderire al vetro e collegare l’ago. Di conseguenza, il rivestimento è necessaria e vitale per il successo del metodo.Attenzione: L’agente di siliconatura è una miscela disponibile in commercio già pronta di eptano e 1,7-dicloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Tabella materiali). È estremamente infiammabile e acutamente tossici. Maneggiare sempre con adeguata PPE all’interno di una cappa aspirante. Per inserire l’ago, caricare ~ µ l di 5−10 dell’agente siliconatura in un micro-iniezione puntale (Tabella materiali). Posizionare la punta di micro-iniezione in estremità larga del vetro tirato capillare e posizionare la punta più lontano giù come possibile (vicino alla punta dell’ago di vetro). Espellere l’agente siliconatura mentre lentamente rimuovendo la pipetta di carico al fine di ridurre al minimo le bolle d’aria nell’ago. Lasciare l’agente siliconatura nell’ago di vetro per 10 min, rimuovere aspirando con una nuova pipetta di caricamento e consentire aghi asciugare per una notte in una cappa aspirante. La mattina dell’esperimento, risciacquare i capillari di vetro con acqua deionizzata seguendo la procedura al punto 1.2 e lasciare per asciugare per 3 − 4 h. 2. preparazione delle soluzioni Preparare 5 mL di tripsina soluzione neutralizzante completando 4,2 mL di medium modificato dell’Aquila di Dulbecco e miscela nutriente di Ham F12 (DMEM/F12) con 750 µ l di siero bovino fetale (FBS) e 50 µ l di penicillina/streptomicina. Conservare a 37 ° C fino all’utilizzo. Preparare 5 µM etichettatura soluzione colorante pipettaggio 5 µ l di brodo di 1mm etichettatura tintura (in dimetilsolfossido [DMSO], Tabella materiali) in 995 µ l di Hank soluzione salina (HBSS) equilibrata. Vortexare per 1 min e store a 37 ° C fino all’utilizzo. Preparare fresco paraformaldeide (PFA) unendo 10 mL della soluzione madre di PFA 32% con 62 mL di acqua di grado di biologia molecolare e 8 mL di soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS): 10x. La concentrazione finale è 4% PFA in 1 x DPBS. 3. preparazione degli embrioni di host Incubare uova fertili del pollo in un orientamento orizzontale in un incubatore a 38 ° C fino a Hamburger e Hamilton (HH) fase 1910.Nota: Il palcoscenico scelto per manipolazione è flessibile e completamente dipendente dagli obiettivi di ogni singolo esperimento. Punteggio ottenuto alla fine “flat” del guscio uovo lungo l’equatore di uovo utilizzando forcipe angolato per fare una piccola puntura > 1 mm di diametro. Inserire un ago da 18 G con annesso 10 mL siringa attraverso la puntura e rimuovere ~ 5 mL di albumina.Nota: Questa posizione anatomica è esterna alla cella di”aria” all’interno dell’uovo e impedisce la fuoriuscita una volta fatta la puntura di albumina. Questo passaggio è consigliato come si “scende” l’embrione lontano il guscio d’uovo, impedire potenziali danni nei passaggi successivi. Applicare nastro trasparente sulla parte superiore del guscio dell’uovo. Punteggio ottenuto con il forcipe angolato e tagliare una finestra di cm ~2.5 usando le forbici tenotomy curvo. Ispezionare e tappa l’embrione in base a criteri stabiliti da Hamburger e Hamilton10 e sigillare la puntura da passo 3.2 con nastro adesivo trasparente.Nota: Qui, embrioni in fase 19 HH sono usati che hanno 37−40 somiti che avanza nel germoglio della coda. La puntura non deve essere sigillata fino a dopo la finestra viene aperta nella parte superiore dell’uovo (punto 3.3). Iniettare ~ 200 µ l di miscela di inchiostro di India/HBSS (1:5) sotto l’embrione usando un ago 32G con siringa da 1 mL allegata.Nota: l’inchiostro di India fornisce contrasto visivo tra l’embrione e il tuorlo sotto. Alternativa tinture come neutra disponibile in commercio o rossa ciano proteina fluorescente (CFP) o set di filtri di fluorescenza della proteina fluorescente blu (BFP) può essere utilizzato per migliorare il contrasto. Aggiungere 1 mL di HBSS goccia a goccia sul disco embrionale e sigillare con finestre conchiglie con film di paraffina. Rimettere le uova nell’incubatrice umidificata fino a che pronto per l’iniezione. 4. isolamento del tessuto del donatore Incubare uova di pollo fertile del donatore in un incubatore a 38 ° C fino a fase HH 19 (o fase desiderata). Rimuovere l’embrione dall’uovo e mettere in una capsula Petri 100 x 15 mm contenente HBSS sterile a temperatura ambiente (TA). Chirurgicamente microdissect tessuto di donatore atriale da ogni embrione prima isolando l’intero cuore embrionale dell’embrione e quindi isolando gli atri dal cuore utilizzando pinze, forbici tenotomy e microspatula sotto uno stereo microscopio per dissezione. Piscina in un tubo del microcentrifuge sterili da 1,5 mL contenente 1 mL di HBSS sul ghiaccio. Una volta che tutto il tessuto donatore è stati raccolti, pallina del tessuto mediante centrifugazione a 1000 x g per 5 min a 4 ° C in una microcentrifuga ad angolo fisso. 5. digestione della tripsina del tessuto del donatore Risospendere il pellet di cellule in 1 mL di preriscaldati 0.05% tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C per 15 min in un blocco di calore agitazione a 300 giri/min. In alternativa, è possibile utilizzare un bagnomaria con agitazione periodica del campione. Dispensare la soluzione di digestione su e giù per rompere qualsiasi tessuto restante e pellet come descritto al punto 4.4. Risospendere il pellet in 1 mL di tripsina neutralizzando soluzione e centrifugare come descritto al punto 4.4. Risospendere le cellule in 400 µ l di rosso fluorescente etichettatura soluzione colorante e incubare a 37 ° C per 20 min in un blocco di calore. In alternativa, utilizzare un bagno d’acqua. Una volta terminata la reazione d’etichettatura, appallottolare le celle come descritto al punto 4.4 e lavare con 1 mL di HBSS (numero di lavaggio passaggi possono essere variate tra 1 e 3). Risospendere le cellule etichettate, pellettate ad una concentrazione di ~ 50.000 cellule / µ l, che si traduce generalmente in un volume di lavoro 5−10 µ l a seconda del rendimento totale delle cellule.Nota: Le concentrazioni cellulari sotto ~ 50.000 cellule / µ l possono provocare l’efficienza scarsa iniezione. 6. in-vivo iniezione Inserire la sospensione cellulare in una pipetta capillare di vetro trattato in silicone seguendo le procedure descritte in passaggio 1.2. Montare la pipetta nell’apparato di microinjector di pressione. Rimuovere gli embrioni host da incubatore e posto in un portauovo sotto il fluorescente stereo microscopio per dissezione. Aprire la membrana vitellina usando una pinzetta sterile e praticare una piccola incisione (~0.5−1.0 mm di lunghezza) nel pericardio. Ulteriore manipolazioni/dissezione può essere necessaria a seconda della regione di destinazione per l’iniezione. Posizionare il microinjector in modo tale che la punta dell’ago microiniezione penetra il tessuto bersaglio. Pressione iniettare le cellule e utilizzare l’etichetta fluorescente per determinare che le cellule impiantate sono presenti nel tessuto desiderato. Per preparazioni iniettabili tipici, applicare singoli impulsi inferiori a 0,5 s in durata che va da 100-400 ettopascal in pressione.Nota: Lunghezza di impulso e la pressione assoluta varierà a seconda del numero delle cellule deve essere iniettato e possono essere modificati per soddisfare le esigenze individuali. Ritrarre l’apparato microinjector e togliere l’uovo dal titolare dopo l’iniezione di pressione. Aggiungere 1 mL di caldo HBSS goccia a goccia sull’embrione, uova usando nastro adesivo trasparente ed incubare nell’incubatore umidificato a 38 ° C per l’impianto di post 24 h. 7. isolamento e analisi Isolare gli embrioni di host in HBSS RT utilizzando pinze, forbici tenotomy e microspatula simile al punto 4.3 e difficoltà nel 4% PFA durante la notte a 4 ° C con dolce dondolio. Lavare gli embrioni 3 x 5 min in HBSS a RT con dolce dondolo e conservare in HBSS a 4 ° C per ulteriori analisi a valle (microscopia, immunoistochimica, ibridazione in situ, ecc.).