Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

כל השיטות המתוארות לדבוק הנחיות טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת צפון קרולינה בצ’פל היל. 1. הכנת מיקרו-הזרקת פיפטות משוך נימים זכוכית באמצעות של פולר micropipette. עבור כמה זריקות, המחט שיפוע מומלץ כפי שהיא מספקת של השטח מושחזות ללא זיהומים מבנית. כדי לעשות זאת, פולנית סוף מחט משך על גלגל מסגרת משופעת בזווית של 45 מעלות למשך דקות 15−20.הערה: ההגדרות המדויק עבור משיכת ישתנו בהתאם פולר בשימוש. הקוטר הפנימי הסופי של השיקוע צריך להיות בין 20−40 מיקרומטר. מעיל של משטחי זכוכית נימי עם סיליקון פנימיים וחיצוניים. קודם לטבול את המחטים, הסוכן siliconizing לו מעיל על המשטח החיצוני של המחט, ואז backload הפתרון הסוכן siliconizing אל כל micropipette כדי להרגיע את השטח הפנימי.הערה: ציפוי של הנימים זכוכית צריך להיעשות 24 שעות לפני הניסוי השרשה. ציפוי זכוכית נימי הדם עם סיליקון מספק משטח אינרטי מבחינה כימית אל הזכוכית. אם הנימים נותרים ללא טיפול, התליה תא שנוצרו בשלבים מאוחר יותר לדבוק הזכוכית וחבר את המחט. לכן, ציפוי הוא הכרחי וחיוני להצלחת השיטה.זהירות: הסוכן siliconizing היא תערובת זמינים מסחרית מוכנות של heptane ב 1, 7-dichloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (טבלה של חומרים). זה דליק ביותר בחריפות רעילים. תמיד לטפל עם עיקרון השוויון הפוליטי הנכון בתוך ברדס fume. כדי backload המחט, לטעון ~ 5−10 µL של סוכן siliconizing לתוך טיפ מיקרו-הזרקת פיפטה (טבלה של חומרים). מקם את הטיפ מיקרו-הזרקת בסוף רחב של הזכוכית משך נימי ומקם את הטיפ עד למטה ככל האפשר (קרוב קצה המחט זכוכית). הוצא את הסוכן siliconizing בעת הסרת לאט על פיפטה העמסה על מנת למזער את בועות האוויר במחט. להשאיר את הסוכן siliconizing המחט זכוכית 10 דקות, להסיר על-ידי כ רפה בעברית עם פיפטה טעינה חדשה ולאפשר מחטים יבש ללון בשכונה fume. בבוקר של הניסוי, לשטוף את נימים זכוכית עם מים יונים בעקבות ההליך בשלב 1.2 ולאפשר לייבוש על 3−4 h. 2. אופן ההכנה של פתרונות להכין 5 מ של טריפסין נטרול פתרון על ידי שכשהם מ 4.2 ל בינונית ששונה הנשרים של Dulbecco, התערובת של בשר חזיר מזין F12 (DMEM/F12) עם 750 µL של העובר שור סרום (FBS), µL 50 של פניצילין/סטרפטומיצין. לאחסן ב 37 ° C עד השימוש. להכין 5 מיקרומטר תיוג לצבוע פתרון על-ידי pipetting µL 5 מניות 1 מ מ תיוג צבען (ב דימתיל סולפוקסיד [דימתיל סולפוקסיד], טבלה של חומרים) לתוך µL 995 של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS). מערבולת 1 דקות, חנות ב 37 ° C עד השימוש. להכין טרי paraformaldehyde (PFA) על ידי שילוב של 10 מ”ל של 32% PFA פתרון מניות 62 מ של מים כיתה ביולוגיה מולקולרית ו- 8 מ של 10 x מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). הריכוז הסופי הוא 4% מחברים ב- 1 x DPBS. 3. הכנת העוברים מארח דגירה ביצי עוף פורייה כיוון אופקי ב חממה humidified ב 38 ° C עד המבורגר והמילטון (HH) 19 בשלב10.הערה: השלב שבחרת עבור מניפולציה הוא תלוי לחלוטין המטרות של כל ניסוי בודדות וגמישים. ניקוד בסוף “שטוח” קליפת ביצה לאורך קו המשווה ביצה באמצעות מלקחיים בזווית כדי לעשות נקב קטן > 1 מ מ קוטר. המחט של 18 גרם עם מזרק מצורף 10 מ”ל דרך הניקוב ולהסיר ~ 5 מ של אלבומין.הערה: מיקום אנטומי זה הוא חיצוני לתא”אוויר” בתוך הביצה ושומר אלבומין דולף לאחר הניקוב. השלב זה מומלץ כמו זה “מפיל” את העובר מן הקליפה ביצה, מניעת נזק פוטנציאלי והשלבים הבאים. השקוף חלות על החלק העליון של קליפת ביצה. ציון עם מלקחיים בזווית וחותכים חלון ס מ ~2.5 באמצעות מספריים tenotomy מעוקל. לבדוק בשלב העובר על פי קריטריונים שנקבעו על-ידי המבורגר והמילטון10 , לאטום הניקוב מהשלב 3.2 עם סלוטייפ.הערה: כאן, שלב HH 19 עוברי משמשים אשר יש somites 37−40 לעומק ניצן הזנב. לא צריך להיות חתום הניקוב עד לאחר החלון נפתח לאורך החלק העליון של הביצה (שלב 3.3). להזריק ~ 200 µL תערובת דיו הודו/HBSS (1:5) מתחת העובר באמצעות מחט 32 G עם מזרק מצורף 1 מ”ל.הערה: אינדיה אינק מספק חדות חזותית בין העובר לבין החלמון מתחת. חלופה צבענים כמו נייטרלי אדום או זמינים מסחרית ציאן חלבון פלואורסצנטי (CFP) או מערכות סינון קרינה פלואורסצנטית כחול חלבון פלואורסצנטי (BFP) יכול לשמש כדי לשפר את הניגודיות. להוסיף 1 מ”ל של HBSS dropwise אל הדיסק העוברי, לאטום פגזים חלון עם סרט פרפין. מניחים ביצים בחזרה בחממה humidified עד מוכן להזרקה. 4. בידוד של רקמה דגירה לתרומת ביציות עוף פורייה ב חממה humidified ב 38 ° C עד שלב HH 19 (או השלב הרצוי). מוציאים את העובר מהביצה ומניחים בצלחת פטרי 100 מ”מ x 15 מ”מ המכיל HBSS סטרילי בטמפרטורת החדר (RT). בניתוח microdissect פרפור רקמה של כל העובר על ידי לראשונה לבודד את הלב העוברי כל העובר ולאחר מכן על-ידי בידוד של אטריה מכל הלב באמצעות מלקחיים, מספריים tenotomy ו- microspatula תחת מערכת סטריאו לנתח מיקרוסקופ. בריכה צינור microcentrifuge mL 1.5 סטרילי המכיל 1 מ”ל של HBSS על הקרח. לאחר שנאספו כל רקמה, גלולה הרקמה על ידי צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות ב 4 ° C ב- microcentrifuge זווית קבועה. 5. טריפסין העיכול של רקמה Resuspend תא כדורי ב 1 מ”ל של טריפסין 0.05% prewarmed-EDTA, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתוך גוש חום חזק ב 300 סל ד. לחלופין, להשתמש באמבט מים עם עצבנות מחזוריים של המדגם. Pipette הפתרון עיכול למעלה ולמטה כדי לשבור את כל רקמות הנותרים, גלולה כמו שלב 4.4. Resuspend בגדר ב 1 מ”ל של טריפסין נטרול פתרון וצנטריפוגה כמו שלב 4.4. Resuspend תאי µL 400 של פלורסנט אדום תיוג פתרון לצבוע, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בתוך גוש חום. לחלופין, להשתמש באמבט מים. לאחר סיום התגובה תיוג, גלולה התאים כמו שלב 4.4 ולשטוף עם 1 מ”ל של HBSS (מספר שטיפת השלבים יכולים להיות מגוונים בין 1 ל- 3). Resuspend התאים שכותרתו, מגורען-ריכוז של ~ 50,000 תאים/µL, שתוצאתה בדרך כלל אמצעי העבודה µL 5−10 בהתאם התשואה cell סך הכל.הערה: תא ריכוזים מתחת ~ 50,000 תאים/µL יכול לגרום יעילות הזרקת המסכן. 6. ב- vivo הזרקה Backload התליה תא לתוך נימי סיליקון הזכוכית שטופלו פיפטה ביצוע הפרוצדורות בשלב 1.2. בעיא פיפטה של המנגנון microinjector הלחץ. להסיר את העוברים מארח חממה humidified ולמקם מחזיק ביצה מתחת הסטריאו פלורסנט לנתח מיקרוסקופ. פתח את הקרום vitelline באמצעות מלקחיים בסדר סטרילי, עושים חתך קטן (~0.5−1.0 מ מ אורך) בהכפורת. ייתכן שיהיה צורך מניפולציה נוספים/ניתוח בהתאם לאזור היעד להזרקה. מקם את microinjector כך קצה המחט microinjection חודר את רקמת המטרה. הלחץ להזריק תאי, ויש להשתמש בתווית פלורסנט כדי לקבוע כי תאים מושתל נמצאים בתוך הרקמה הרצויה. לזריקות טיפוסי, החל פולסים יחיד פחות מ- 0.5 s במשך זמן הנע בין 100-400 hectopascals בלחץ.הערה: ללחץ מוחלט לאורכה של הדופק משתנה בהתאם מספר התאים כדי להיות מוזרק, יכול להיות שונה כדי להתאימה לצרכיו האישיים. . משכי את המנגנון microinjector ולהסיר את הביצה ממחזיק אחרי הזרקת לחץ. להוסיף 1 מ”ל של HBSS חמים dropwise אל העובר, לאטום ביצים באמצעות דבק סלוטפ שקוף, דגירה בחממה humidified ב 38 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה שלאחר ההשתלה. 7. בידוד וניתוח לבודד את העוברים מארח ב- RT HBSS באמצעות מלקחיים, מספריים tenotomy microspatula דומה לשלב 4.3, ותקן ב 4% מחברים בין לילה ב 4 ° C עם נדנדה עדין. לשטוף את העוברים 3 x 5 דקות ב- HBSS ב RT עם נדנדה עדין, ולאחסן ב- HBSS ב 4 ° C עבור במורד הזרם ניתוח נוסף (מיקרוסקופ, אימונוהיסטוכימיה, הכלאה מקומיים, וכו ‘.).