Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Alle beschriebene Methoden befolgen Tierbetreuung Richtlinien der University of North Carolina in Chapel Hill. 1. Vorbereitung der Mikro-Injektion Pipetten Ziehen Sie mit einer Mikropipette Puller Glaskapillaren. Für einige Injektionen ist Nadel Abschrägung empfohlen, da es eine extrem scharfe Oberfläche frei von strukturellen Verunreinigungen bietet. Zu diesem Zweck polnische ein gezogener Nadelspitze auf einem abschrägen Rad in einem Winkel von 45° 15−20 Minuten.Hinweis: Genaue Einstellung für das Ziehen von variiert je nach der Abzieher verwendet wird. Der endgültige inneren Durchmesser der Abschrägung sollte zwischen 20−40 µm betragen. Bestreichen Sie die inneren und äußeren Oberflächen des Glases Kapillare mit Silikon. Zunächst Tauchen Sie die Nadeln in den siliconizing Agenten, die äußere Oberfläche der Nadel und dann Backload die siliconizing Agents Lösung in jedem Mikropipette zur Beschichtung von der inneren Oberfläche zu beschichten.Hinweis: Beschichtung von der Glaskapillaren sollte 24 h vor der Implantation-Experiment durchgeführt werden. Glaskapillaren mit Silikon Beschichtung sorgt für eine chemisch inerte Oberfläche auf das Glas. Wenn die Kapillaren übrig sind wird unbehandelt, die Zellsuspension in späteren Schritten generiert und halten uns an das Glas stecken Sie die Nadel. Beschichtung ist daher notwendig und entscheidend für den Erfolg der Methode.Achtung: Der siliconizing Agent ist eine fertige handelsübliche Mischung aus Heptan und 1,7-Dichlor-1,1,3,3,5,5,7,7-Octamethyltetrasiloxane (Table of Materials). Es ist hochentzündlich und akut toxisch. Fassen Sie immer mit richtigen PSA innerhalb einer Abzugshaube. Backload die Nadel, laden ~ 5−10 µL des siliconizing Agents in einem Mikro-Injektion Pipettenspitze (Table of Materials). Setzen Sie die Mikro-Injektion-Spitze in das breite Ende von gezogenem Glas Kapillare und positionieren Sie die Spitze so weit unten wie möglich (in der Nähe der Nadelspitze Glas). Auswerfen des siliconizing Agents beim Entfernen langsam der Beladung Pipette um Luftblasen in der Nadel zu minimieren. Verlassen Sie die siliconizing Agents in der Glasnadel für 10 min, entfernen Sie, indem Sie mit einer neuen Laden-Pipette Absaugen und lassen Sie zu, dass Nadeln in einer Abzugshaube über Nacht trocknen. Am Morgen des Experiments, spülen Sie die Glaskapillaren mit entionisiertem Wasser nach dem Verfahren in Schritt 1.2 und 3−4 h trocknen lassen. 2. Vorbereitung der Lösungen Bereiten Sie 5 mL Trypsin neutralisierende Lösung durch die Ergänzung von 4,2 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium und Hams Nährstoff Gemisch F12 (DMEM/F12) mit 750 µL des fetalen Bovine Serum (FBS) und 50 µL von Penicillin/Streptomycin vor. Bei 37 ° C bis zur Verwendung aufbewahren. Bereiten Sie 5 µM Kennzeichnung Farbstofflösung durch Pipettieren 5 µL 1 mM Lager Kennzeichnung Farbstoff (in Dimethyl Sulfoxid [DMSO], Table of Materials) in 995 µL Hank Salzlösung (HBSS) ausgeglichen. Vortex für 1 min und bei 37 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern. Bereiten Sie frische Paraformaldehyd (PFA) durch die Kombination von 10 mL 32 % PFA-Stammlösung mit 62 mL Molekularbiologie Grad Wasser und 8 mL 10 x Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS). Die Endkonzentration beträgt 4 % PFA in 1 X DPBS. 3. Vorbereitung des Host-Embryonen Inkubieren Sie fruchtbaren Eier in eine horizontale Ausrichtung in einem befeuchteten Inkubator bei 38 ° C bis zum Hamburger und Hamilton (HH) Etappe 1910.Hinweis: Die Bühne für Manipulation gewählt ist flexibel und völlig abhängig von den Zielen jedes einzelnen Experiment. Ergebnis “flache” Ende der Eierschale am Ei Äquator mit abgewinkelten Pinzette, um ein kleines Loch zu machen > 1 mm im Durchmesser. Einfügen ein 18 G-Nadel mit angehängten 10 mL Spritze durch die Punktion und ~ 5 mL Albumin zu entfernen.Hinweis: Diese anatomische Lage ist außerhalb der “Luft-Zelle” innerhalb des Eies und hält Albumin vom lecken, sobald die Punktion erfolgt. Dieser Schritt wird empfohlen, da es “fällt” den Embryo von der Eierschale, Verhinderung von möglichen Schäden in den nachfolgenden Schritten. Gelten Sie durchsichtiges Klebeband an die Spitze der Eierschale. Punkten mit abgewinkelten Pinzette und einem ~2.5 cm Fenster mit gebogenen Tenotomie Schere schneiden. Prüfen und den Embryo basierend auf Hamburger und Hamilton10 festgelegten Kriterien zu inszenieren und die Punktion von Schritt 3.2 mit Tesafilm zu versiegeln.Hinweis: Hier werden HH 19 Embryonen verwendet, die 37−40 Somiten bis ins Heck Keim haben. Die Punktion sollte nicht bis versiegelt werden, nachdem das Fenster am oberen Rand das Ei (Schritt 3.3) geöffnet ist. Tusche/HBSS Mischung (1:5) unter den Embryo mit einer 32 G-Nadel mit angehängten 1 mL Spritze ~ 200 µL zu injizieren.Hinweis: Indien Tinte bietet visuellen Kontrast zwischen dem Embryo und das Eigelb unter. Alternative Farbstoffe wie neutral rot oder handelsüblichen Cyan fluoreszierenden Proteins (GFP) oder blau fluoreszierenden Proteins (BFP) Fluoreszenz Filtersätze eingesetzt werden, um Kontrast zu verbessern. Fügen Sie 1 mL HBSS tropfenweise auf der embryonalen Scheibe und Dichtung Fenstermodus Schalen mit Paraffin Film. Legen Sie Eier zurück in den befeuchteten Inkubator bis bereit zur Injektion. 4. Isolierung von Spendergewebe Inkubieren Sie Spender fruchtbaren Hühnereier in einem befeuchteten Inkubator bei 38 ° C bis Stufe HH 19 (oder gewünschte Stufe). Entfernen Sie den Embryo aus dem Ei zu und in ein 100 x 15 mm Petrischale mit sterilem HBSS bei Raumtemperatur (RT). Chirurgisch Microdissect Vorhofflimmern Spendergewebe von jedem Embryo indem zuerst das gesamte embryonale Herz des Embryos zu isolieren und dann durch die Isolierung der Vorhöfe aus dem Herzen Zange, Tenotomie Scheren und Microspatula unter einem Stereo Mikroskop seziert. Pool in einem sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 1 mL HBSS auf Eis. Sobald alle Spendergewebe gesammelt hat, pellet-das Gewebe durch Zentrifugation bei 1000 X g für 5 min bei 4 ° C in einem festen Winkel Microcentrifuge. (5) Trypsin-Verdauung von Spendergewebe Aufschwemmen Sie Zelle Pellets in 1 mL vorgewärmte 0,05 % Trypsin-EDTA und bei 37 ° C für 15 min in ein Schütteln Heizblock bei 300 u/min inkubieren. Alternativ können Sie ein Wasserbad mit periodischer Erregung der Probe. Pipette der Aufschlusslösung rauf und runter um jede verbleibende Gewebe aufzubrechen, und wie in Schritt 4.4 pellet. Aufzuwirbeln Sie das Pellet in 1 mL der Trypsin neutralisierende Lösung und Zentrifuge wie in Schritt 4.4. Zellen in 400 µL rot fluoreszierende Farbstofflösung Kennzeichnung Aufschwemmen und Inkubation bei 37 ° C für 20 min in einem Hitze-Block. Alternativ können Sie ein Wasserbad. Sobald die Kennzeichnung Reaktion abgeschlossen ist, die Zellen wie in Schritt 4.4 pellet und waschen mit 1 mL HBSS (Anzahl der Wäsche, die Schritte 1 bis 3 variiert werden können). Aufzuwirbeln Sie die beschrifteten, gebeizte Zellen in einer Konzentration von ~ 50.000 Zellen/µL, die in der Regel ergibt sich eine 5−10 µL Arbeitsvolumen abhängig von der gesamten Zellausbeute.Hinweis: Zelle Konzentrationen unterhalb ~ 50.000 Zellen/µL können schlechte Injektion Effizienz führen. 6. in-Vivo-Injektion BackLoad die Zellsuspension in eine Silikon behandelten Kapillare Glaspipette nach den Verfahren in Schritt 1.2. Montieren Sie die Pipette in den Druck-Microinjector-Apparat. Entfernen Sie Host Embryonen aus befeuchteten Inkubator und setzen Sie in ein Ei-Halter unter den fluoreszierenden Stereo Mikroskop seziert. Öffnen Sie die Dotterhäutchen Membran mit sterilen feinen Pinzette und machen Sie einen kleinen Schnitt (~0.5−1.0 mm in der Länge) in den Herzbeutel. Weitere Manipulation/Dissektion kann je nach Zielregion zur Injektion erforderlich sein. Positionieren Sie die Microinjector so, dass die Mikroinjektion Nadelspitze dringt in das Zielgewebe. Druck injizieren Zellen und das fluoreszierende Label zu verwenden, um festzustellen, dass die implantierte Zellen in gewünschte Gewebe vorhanden sind. Typische Injektionen beantragen, Einzelimpulse von weniger als 0,5 s Dauer von 100-400 Hektopascal in Druck.Hinweis: Pulslänge und Absolutdruck ist abhängig von der Anzahl der Zellen injiziert werden und können individuell geändert werden. Einfahren Sie der Microinjector Apparat und entfernen Sie das Ei nach der Injektion von Druck aus der Halterung zu. Fügen Sie 1 mL warmen HBSS tropfenweise auf den Embryo, Eier mit transparentem Klebeband versiegeln und brüten in den befeuchteten Inkubator bei 38 ° C für 24 h Post Implantation. (7) Isolierung und Analyse Host-Embryonen in RT HBSS mit Zange, Tenotomie Schere und Microspatula ähnlich wie Schritt 4.3 isolieren und in 4 % PFA über Nacht bei 4 ° C mit sanftes Schaukeln zu beheben. Waschen Sie Embryonen 3 x 5 min in HBSS bei RT mit sanftes Schaukeln, und speichern Sie in HBSS bei 4 ° C für weitere nachgelagerte Analyse (Mikroskopie, Immunohistochemistry, in-Situ-Hybridisierung, etc.).