Microinjection-gebaseerd systeem voor In Vivo implantatie van embryonale Cardiomyocytes in het aviaire Embryo

Alle methodes beschreven merkvoorschriften dierenverzorgers van The University of North Carolina te Chapel Hill. 1. bereiding van micro-injectie pipetten Glazen capillairen met behulp van een micropipet trekker trek. Voor sommige injecties, wordt naald Afschuining aanbevolen omdat zij een uiterst scherp oppervlak verstoken van structurele onzuiverheden vormt. Pools om dit te doen, het einde van een getrokken naald op een beveling wiel in een hoek van 45° voor 15−20 min.Opmerking: De exacte instellingen voor het trekken van zal variëren op basis van de trekker wordt gebruikt. De definitieve binnendiameter van de schuine kant moet tussen 20−40 µm. Coat de binnenste en de externe oppervlakken van de glazen capillaire met silicone. Eerste duik de naalden in de siliconizing agent jas van het buitenoppervlak van de naald en vervolgens de backload de siliconizing agent-oplossing in elk micropipet jas van de binnenzijde.Opmerking: Coating van de haarvaten glas moet gebeuren 24 h vóór de implantatie-experiment. De haarvaten glas met siliconen coating biedt een chemisch inert oppervlak aan het glas. Als de haarvaten worden verlaten zal onbehandeld, de celsuspensie gegenereerd in latere stappen houden aan het glas en steek de naald. Coating is daarom noodzakelijk en essentieel voor het succes van de methode.Let op: De siliconizing agent is een kant en klare commercieel verkrijgbare mengsel van heptaan en 1,7-dichloorethaan-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Tabel van materialen). Het is zeer licht ontvlambaar en acuut toxisch. Altijd omgaan met goede PPE in een zuurkast. Om backload de naald, laden ~ 5−10 µL van de siliconizing agent in een micro-injectie pipette uiteinde (Tabel van materialen). Plaats het uiteinde van de micro-injectie in het brede einde van de getrokken glazen capillaire en plaats de tip zo ver naar beneden als mogelijk (dichtbij het glas naald tip). Verwijder de siliconizing agent tijdens het langzaam het verwijderen van de pipet laden om te minimaliseren van luchtbellen in de naald. Laat de siliconizing agent in de glas-naald voor 10 min, verwijderen door met een nieuwe lading pipet zuigen en laat naalden droog ‘s nachts in een zuurkast. De ochtend van het experiment, de haarvaten glas met gedeïoniseerd water na de procedure in stap 1.2 afspoelen en laten drogen voor 3−4 h. 2. bereiding van de oplossingen 5 mL trypsine oplossing te neutraliseren door aan te vullen 4.2 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle’s medium en Ham van nutriënten mengsel F12 (DMEM/F12) met 750 µL van foetale boviene Serum (FBS) en 50 µL van penicilline/streptomycine voor te bereiden. Bewaren bij 37 ° C tot gebruik. Bereiden van 5 µM labeling oplossing kleurstof door pipetting 5 µL van 1 mM voorraad labeling kleurstof (in dimethylsulfoxide [DMSO], Tabel of Materials) in 995 µL van Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS). Vortex voor 1 min en winkel bij 37 ° C tot gebruik. Bereiden van verse paraformaldehyde (PFA) door het combineren van 10 mL van de stockoplossing van 32% PFA met 62 mL moleculaire biologie rang water en 8 mL van 10 x de Dulbecco-fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). De eindconcentratie is 4% PFA in 1 x DPBS. 3. voorbereiding van de host embryo ‘s Incubeer vruchtbare kippeneieren in een horizontale richting in een bevochtigde incubator bij 38 ° C tot Hamburger en Hamilton (HH) etappe 1910.Opmerking: Het podium gekozen voor manipulatie is flexibel en volledig afhankelijk van de doelstellingen van elk afzonderlijk experiment. Score van de ‘platte’ einde van de eierschaal langs de evenaar van de ei met behulp van schuine pincet te maken van een kleine lekke band > 1 mm in diameter. Invoegen van een naald 18 G met bijgevoegde 10 mL spuit via de lekke band en verwijder ~ 5 mL albumine.Opmerking: Deze anatomische locatie zich buiten de “lucht cel” binnen het ei en albumine weerhoudt lekken zodra de punctie is gemaakt. Deze stap wordt aanbevolen als het “drops” het embryo uit de buurt van de eierschaal, voorkomen van mogelijke schade in de opeenvolgende stappen. Het toepassen van transparante tape op de bovenkant van de eierschaal. Scoren met een schuine Tang en een ~2.5 cm venster met gebogen tenotomy schaar te knippen. Inspecteren en etappe van het embryo op basis van criteria die zijn vastgesteld door Hamburger en Hamilton10 en verzegel de punctie uit stap 3.2 met transparante tape.Opmerking: Hier, fase HH 19 embryo’s worden gebruikt die hebben 37−40 somieten uitbreiden in de kiem van de staart. Het lek worden niet verzegeld tot nadat het venster is geopend langs de bovenkant van het ei (stap 3.3). ~ 200 µL van Oost-Indische inkt/HBSS mengsel (1:5) onder het embryo met behulp van een 32 G naald met bijgevoegde 1 mL spuit te injecteren.Opmerking: Oost-Indische inkt biedt visueel contrast tussen het embryo en de dooier onder. Alternatieve kleurstoffen zoals neutrale rode of verkrijgbare cyaan fluorescente proteïne (GVB) of blauwe fluorescerende eiwit (BFP) fluorescentie filter sets kunnen worden gebruikt om het contrast te verbeteren. Voeg vervolgens 1 mL van HBSS ontkleuring op de embryonale schijf en verzegel windowed schelpen met paraffine film. Plaats de eieren terug in de bevochtigde incubator tot klaar voor de injectie. 4. isolatie van donorweefsel Incubeer donor vruchtbare kippeneieren in een bevochtigde incubator bij 38 ° C tot fase HH 19 (of gewenste fase). Verwijder het embryo uit het ei en plaats in een 100 x 15 mm petrischaal met steriele HBSS bij kamertemperatuur (RT). Operatief microdissect atriale donorweefsel van elk embryo door eerst het gehele embryonale hart van het embryo te isoleren en vervolgens door het isoleren van de atria van het hart via pincet, schaar van tenotomy en microspatula onder een stereo microscoop ontleden. Zwembad in een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis met 1 mL HBSS op ijs. Zodra alle donorweefsel is verzameld, pellet het weefsel door centrifugeren bij 1000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C in een vaste-hoek microcentrifuge. 5. trypsine vertering van donorweefsel Resuspendeer cel pellets in 1 mL voorverwarmde 0.05% trypsine-EDTA en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min. in een schudden warmte blok bij 300 omwentelingen per minuut. Ook gebruiken een waterbad met periodieke agitatie van het monster. Pipetteer de spijsvertering oplossing op en neer te breken alle resterende weefsel, pellet zoals in stap 4.4. Resuspendeer de pellet in 1 mL van de trypsine neutraliseren oplossing en centrifuge zoals in stap 4.4. Resuspendeer de cellen in 400 µL van rode fluorescerende kleurstof oplossing labeling en Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 min. in een blok van de warmte. Ook gebruiken een waterbad. Zodra de labeling reactie wordt gebeëindigd, de cellen zoals in stap 4.4 pellet en wassen met 1 mL van HBSS (aantal wassen stappen kunnen gevarieerd worden tussen 1 en 3). Resuspendeer de cellen van het gelabelde, Ingehuld bij een concentratie van ~ 50.000 cellen/µL, wat over het algemeen resulteert in een 5−10 µL werken volume afhankelijk van de cel Totaal rendement.Opmerking: Cel concentraties beneden ~ 50.000 cellen/µL kunnen resulteren in slechte injectie efficiëntie. 6. in-vivo-injectie Backload de celsuspensie in een siliconen behandelde glazen capillaire pipet volgens de procedure in stap 1.2. Monteer de pipet op de druk microinjector apparaat. Host embryo’s uit bevochtigde incubator verwijderen en plaatsen in de houder van een ei onder de fluorescerende stereo microscoop ontleden. Open het vitelline membraan met behulp van steriele fijne pincet en maak een kleine incisie (~0.5−1.0 mm in lengte) in het hartzakje. Extra manipulatie/dissectie kan afhankelijk van doel regio voor injectie nodig zijn. Plaats de microinjector zodanig dat het uiteinde van de naald microinjection het doelweefsel doordringt. Druk injecteren van cellen en de fluorescerende label gebruiken om te bepalen dat geïmplanteerde cellen in gewenste weefsel aanwezig zijn. Voor typische injecties, gelden enkele pulsen van minder dan 0,5 s in duur variërend van 100-400 hectopascal in druk.Opmerking: Pulslengte absolute druk zal variëren afhankelijk van het aantal cellen te worden geïnjecteerd en kan worden aangepast voor individuele behoeften. Het microinjector apparaat intrekken en verwijder het ei uit de houder na het injecteren van de druk. Voeg 1 mL warme HBSS ontkleuring op het embryo, verzegelen met behulp van transparante verpakkingstape eieren en broeden in de bevochtigde incubator bij 38 ° C voor 24u post implantatie. 7. isolatie en analyse Isoleren van embryo’s die gastheer in RT HBSS met pincet, tenotomy schaar en microspatula vergelijkbaar met stap 4.3, en monteren in 4% PFA overnacht bij 4 ° C met zachte rockende. Embryo’s 3 x 5 min in HBSS op RT wassen met zacht rockende, en op te slaan in HBSS bij 4 ° C voor verder stroomafwaarts analyse (microscopie, immunohistochemistry, in-situ hybridisatie, enz.).