النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

جميع الأساليب المذكورة التقيد بالمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان من “جامعة شمال كارولاينا” في تشابل هيل. 1-إعداد الماصات الدقيقة-حقن سحب الشعيرات الزجاج باستخدام ساحبة ميكروبيبيتي. تجليف إبرة يوصي لبعض الحقن، كما أنه يوفر سطح حاد جداً خالية من الشوائب الهيكلية. للقيام بذلك، البولندية نهاية إبرة سحبت على عجلة الشطف بزاوية مقدارها 45 درجة لمدة دقيقة 15−20.ملاحظة: إعدادات الضبط لسحب تتنوع استناداً إلى ساحبة المستخدمة. يجب أن يكون القطر الداخلي النهائي المجسم مشطوف الحواف بين مكم 20−40. معطف السطوح الداخلية والخارجية من الزجاج الشعرية مع سيليكون. أولاً تراجع الإبر في عامل سيليكونيزينج معطف السطح الخارجي لابره ومن ثم باكلواد الحل وكيل سيليكونيزينج في كل ميكروبيبيتي معطف السطح الداخلي.ملاحظة: ينبغي طلاء من الشعيرات الدموية الزجاج 24 ساعة قبل التجربة غرس. طلاء الزجاج الشعيرات الدموية مع سيليكون يوفر سطح خاملة كيميائيا للزجاج. إذا تركت الشعيرات الدموية دون علاج، ستلتزم بالزجاج وتوصيل الإبرة تعليق الخلية التي تم إنشاؤها في الخطوات اللاحقة. ولذلك، طلاء ضروري وحيوي لنجاح هذه الطريقة.تنبيه: عامل سيليكونيزينج خليط متوفر تجارياً جاهزة هيبتان و 1.7-ثنائي-1,1,3,3,5,5,7,7-أوكتاميثيلتيتراسيلوكساني (جدول المواد). وسريعة الاشتعال للغاية وشديدة السمية. دائماً التعامل مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة داخل غطاء دخان. باكلواد الإبرة، تحميل ~ ميليلتر 5−10 وكيل سيليكونيزينج في تلميح ماصة الصغرى-حقن (جدول المواد). ضع نصيحة الحقن الدقيقة في نهاية نطاق واسع من الزجاج سحبت الشعرية وموقف التلميح حتى أسفل قدر الإمكان (بالقرب من الحافة إبرة الزجاج). إخراج عامل سيليكونيزينج أثناء إزالة ماصة تحميل ببطء للتقليل من فقاعات الهواء في الإبرة. ترك عامل سيليكونيزينج في الإبرة الزجاجية لمدة 10 دقائق وإزالة بواسطة يسفط مع ماصة تحميل جديدة والسماح بالإبر الجافة بين عشية وضحاها في غطاء دخان. شطف الزجاج الشعيرات الدموية بالمياه بعد الإجراء في الخطوة 1.2 صباح اليوم للتجربة، والسماح الجاف ح 3−4. 2-إعداد الحلول إعداد 5 مل من تحييد الحل بتكميل مل 4.2 المتوسطة تعديل النسر دولبيكو ومزيج في لحم الخنزير المغذيات F12 (DMEM/F12) مع 750 ميليلتر من مصل البقر الجنين (FBS) و 50 ميليلتر من البنسلين/ستربتوميسين التربسين. تخزين في 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. إعداد 5 ميكرومتر وسم صبغ الحل قبل بيبيتينج ميليلتر 5 المخزون 1 ملم وسم صبغ (في ثنائي ميثيل سلفوكسيد [[دمس]]، الجدول للمواد) إلى 995 ميليلتر من هانك لموازنة الحل الملح (حبس). دوامة 1 دقيقة ومخزن في 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. إعداد بارافورمالدهيد الطازجة (PFA) عن طريق الجمع بين 10 مل من 32% PFA حل الأسهم مع 62 مل من المياه الصف البيولوجيا الجزيئية ومل 8 من 10 × الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس). أن تركيز النهائي هو 4% الأرجنتينية في 1 x DPBS. 3-إعداد الأجنة المضيفة احتضان بيض الدجاج الخصبة في اتجاه أفقي في حاضنة هوميديفيد في 38 درجة مئوية حتى همبرغر وهاملتون (ح ح) 19 المرحلة10.ملاحظة: المرحلة التي اختيرت للتلاعب بالمرونة ويعتمد كلياً على أهداف كل تجربة فردية. نقاط نهاية “مسطح” شل البيض على طول خط الاستواء البيض باستخدام الملقط الزاوية جعل ثقب صغير > 1 ملم في القطر. إدراج إبرة ز 18 مع حقنه 10 مل المرفقة من خلال ثقب وإزالة ~ 5 مل الزلال.ملاحظة: هذا الموقع التشريحية الخارجية إلى “خلية الهواء” داخل البيضة ويحافظ الزلال من تسريب لمجرد الثقب. يوصي بهذه الخطوة كما أنها “قطرات” الجنين بعيداً عن شل البيض، الحيلولة دون احتمال حدوث تلف في الخطوات اللاحقة. تطبيق الشريط الشفاف إلى الجزء العلوي من وعاء البيض. نقاط مع الملقط الزاوية وقطع نافذة سم ~2.5 باستخدام مقص تينوتومي منحنية. افحص ومرحلة الجنين استناداً إلى معايير وضعتها همبرغر وهاملتون10 وختم الثقب من الخطوة 3.2 بشريط شفاف.ملاحظة: هنا، المرحلة 19 سمو أجنة تستخدم لها سميتس 37−40 تمتد إلى مهدها الذيل. لا تكون مختومة الثقب حتى بعد أن يتم فتح النافذة على طول الجزء العلوي من البيض (الخطوة 3، 3). حقن ~ 200 ميليلتر من خليط الحبر الهند/هبس (1:5) تحت الجنين باستخدام إبرة ز 32 مع المحاقن المرفقة 1 مل.ملاحظة: توفر الحبر الهند البصرية والتباين بين الجنين وصفار البيض تحت. الأصباغ البديلة مثل محايدة أحمر أو المتاحة تجارياً السماوي الفلورسنت البروتين (CFP) أو مجموعات التصفية fluorescence البروتينات الفلورية الزرقاء (حزب الحرية) يمكن استخدامها لتحسين التباين. أضف 1 مل حبس dropwise على القرص الجنيني وختم قذائف إطارات مع الفيلم البارافين. وضع البيض مرة أخرى في حاضنة هوميديفيد حتى جاهزة للحقن. 4-عزل الأنسجة المانحين احتضان بيض الدجاج خصبة المانحين في حاضنة هوميديفيد في 38 درجة مئوية حتى مرحلة سمو 19 (أو المرحلة المطلوب). إزالة الجنين من البيض ووضعه في طبق بتري 100 ملم × 15 ملم تحتوي على حبس العقيمة في درجة حرارة الغرفة (RT). جراحيا ميكروديسيكت المانحة أذينية الأنسجة من كل جنين أولاً عزل قلب الجنين كامل من الجنين وثم عزل اتريا من القلب باستخدام الملقط، والمقص تينوتومي وميكروسباتولا تحت ستيريو تشريح مجهر. تجمع في أنبوب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل يحتوي على 1 مل حبس على الجليد. بمجرد قد تم جمع جميع المانحين الأنسجة، بيليه الأنسجة بالطرد المركزي في 1000 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في ميكروسينتريفوجي زاوية ثابتة. 5-التربسين هضم الأنسجة المانحين ريسوسبيند الكريات الخلية في 1 مل بريوارميد 0.05% التربسين-يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في كتلة حرارة اهتزاز 300 لفة في الدقيقة. بدلاً من ذلك، استخدام حمام مائي مع الإثارة الدورية للعينة. “الماصة؛” الحل الهضم صعودا وهبوطاً لتفريق أي الأنسجة المتبقية، وبيليه كما في الخطوة 4، 4. ريسوسبيند بيليه في 1 مل التربسين تحييد الحل وأجهزة الطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 4، 4. ريسوسبيند الخلايا في 400 ميليلتر من الأحمر نيون وسم الحل صبغ واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في كتلة حرارة. بدلاً من ذلك، استخدام حمام مائي. بمجرد الانتهاء من وضع العلامات رد فعل بيليه الخلايا كما في الخطوة 4، 4 وتغسل مع 1 مل حبس (عدد غسل خطوات يمكن أن تختلف بين 1 و 3). ريسوسبيند الخلايا المسمى، والأعلاف بتركيز ~ 50,000 الخلايا/ميليلتر، مما يؤدي عادة في مجلد 5−10 عامل ميليلتر تبعاً للخلية إجمالي العائد.ملاحظة: يمكن أن يسفر عن تركيزات خلية أسفل ~ 50,000 الخلايا/ميليلتر حقن ضعف الكفاءة. 6-في فيفو حقن باكلواد تعليق خلية في سيليكون زجاج معالجة ماصة شعرية اتباع الإجراءات المذكورة في الخطوة 1.2. جبل الماصة في جهاز ميكروينجيكتور الضغط. إزالة الأجنة المضيفة من حاضنة هوميديفيد ووضعه في حائز بيض تحت الاستريو الفلورسنت تشريح مجهر. فتح الغشاء فيتيلين استخدام الملقط غرامة العقيمة وجعل شق صغير (~0.5−1.0 ملم في الطول) في تامور. قد تكون هناك حاجة إضافية التلاعب/تشريح تبعاً للمنطقة المستهدفة للحقن. ضع ميكروينجيكتور أن طرف الإبرة microinjection تخترق الأنسجة المستهدفة. ضغط حقن الخلايا، واستخدم التسمية الفلورسنت لتحديد أن مزروع خلايا موجودة في الأنسجة المرجوة. لحقن نموذجي، تطبيق نبضات واحد أقل من 0.5 s في مدة تتراوح ما بين 100-400 درجة في الضغط.ملاحظة: طول النبض والضغط المطلق سوف تختلف تبعاً لعدد الخلايا بالحقن ويمكن تعديلها لتناسب الاحتياجات الفردية. التراجع عن جهاز ميكروينجيكتور، وإزالة البيض من الحامل بعد ضغط الحقن. إضافة 1 مل حبس الحارة دروبويسي على الجنين وختم البيض باستخدام الشريط التعبئة شفافة واحتضان في الحاضنة هوميديفيد في 38 درجة مئوية لغرس بعد 24 ساعة. 7-عزل وتحليل عزل الأجنة المضيفة في حبس RT باستخدام ملقط ومقص تينوتومي ميكروسباتولا مشابهة للخطوة 4.3، وإصلاح في 4% بين عشية وضحاها منهاج عمل بيجين في 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف. تغسل الأجنة 3 x 5 دقيقة في حبس في الرايت مع هزاز لطيف، وتخزينها في حبس عند 4 درجة مئوية لمزيد من التحليل المصب (الفحص المجهري، إيمونوهيستوتشيميستري، والتهجين في الموقع، إلخ.).