Çift oküler sulkus görselleştirme Danio rerio embriyogenez sırasında
Summary
Burada, standart bir dizi protokol üstün oküler sulkus gözlemlemek için mevcut bir son zamanlarda tespit, evrimsel korunmuş yapısı omurgalı gözü önünde. Zebra balığı larva kullanarak, oluşumu ve üstün oküler sulkus kapatılması için katkıda faktörleri belirlemek için gerekli teknikleri göstermektedir.
Abstract
Konjenital oküler coloboma genellikle eksik choroid yarığın kapanması sonucu göz aşağı yönüyle bir yarık olarak gözlenen genetik bir hastalıktır. Son zamanlarda, olan bireylerin coloboma Iris, retina ve objektif bir roman yapısı, keşif için liderliğindeki üstün yönüyle üstün çatlak veya dorsal üzerinde geçici mevcut üstün oküler sulkus (SOS), olarak başvurulan kimliği omurgalı gözü geliştirme sırasında optik cup yönünü. Her ne kadar bu yapı fareler, piliç, Balık ve su keleri arasında korunmuş, imdat geçerli anlayışımızı sınırlıdır. Onun oluşumu ve kapatılması için katkıda bulunan faktörler aydınlatmak için gözlemlemek ve anormallikler, imdat kapatma gecikmesi gibi tanımlamak edebilmek için zorunludur. Burada, verimli bir şekilde SOS immünfloresan boyama ve mRNA gibi ortak moleküler biyoloji teknikleri yaygın olarak kullanılan mikroskobu tekniklerle birleştirerek görselleştirmek için kullanılan iletişim kuralları standart bir dizi oluşturmak için yola çıktı overexpression. Bu iletişim kuralları kümesi SOS kapatma gecikme gözlemlemek yeteneği üzerinde duruluyor iken deneyci’nın ihtiyaçlarına adapte edilebilir ve kolayca değiştirilebilir. Genel olarak, biz hangi aracılığıyla SOS anlayışımızı omurgalı gözü geliştirme geçerli bilgisini artırmak için gelişmiş olabilir ulaşılabilir bir yöntem oluşturmak umut.
Introduction
Omurgalı göz oluşumu dikkatle düzenledi hücreler arası sinyal yolları doku türleri oluşturabilir ve bölgesel kimlik1belirtebilirsiniz son derece korunmuş bir süreçtir. Tedirginlikler erken göz morfogenez için derin hataları göz mimarisi için neden ve sık sık2kör. Böyle bir hastalık choroid oküler fissür optik cup3ventral tarafta kapatmak için hata oluşur. Oküler coloboma bilinen bu bozukluk 1 4-5000 canlı doğum ve yaygın olarak kasılır öğrenci göz4ortasına gelen çıkıntı bir anahtar deliği benzeri yapı olarak tezahür Pediatrik körlüğü % neden 3-11 dışında gerçekleşmesi için tahmin edilmektedir, 5,6. Choroid yarığın geçmesi yarığın kenarlarında gemilerin7alın için sigorta optik bardağa büyüyen erken damarlara için bir giriş noktası sağlarlar işlevidir.
Oküler coloboma eski zamanlardan beri bilinen iken, biz son zamanlarda göz çift/dorsal yönünü etkileyen doku kaybı ile yeni bir alt coloboma hastaların belirledik. Son bizim laboratuvar çalışmalarında biz üstün oküler sulkus (SOS) veya üstün fissür8bakın Zebra balığı dorsal göz oküler yapısında keşif açmıştır. Yapı özellikleri bir sulkus ve bir çatlak olduğunu unutmamak gerekir. Benzer şekilde bir sulkus, o zamansal retina nazal yayılan bir sürekli doku katmanıdır. Buna ek olarak, yapısının kapatılması membran karşıt iki bir füzyon tarafından aracılı değil ve görünüşe göre hangi hücreleri tarafından Yapı doldurulur morfogenetik bir süreç gerektirir. Ancak, benzer bir çatlak, bu membran ile dorsal göz burun ve zamansal tarafında ayıran bir yapı oluşturur. Tutarlılık sağlamak için biz ona SOS Bu metinde sevk edecektir.
İmdat örümceklerle omurgalılar, balık, tavuk, newt ve fare8göz morfogenez sırasında görünür olmak arasında korunmuş. Zebra balığı içinde 20-60 saat sonrası döllenme (hpf) üzerinden mevcuttur, choroid yarığın aksine SOS 20-23 hpf kolayca görünür olmak son derece geçici ve yok 26 hpf8tarafından. Son araştırma laboratuarımızın içinde benzer şekilde choroid fissür, SOS bir rol göz morfogenez8sırasında damar rehberlikte oynar, buldu. Olsa da oluşumu ve SOS kapatılması kontrol faktörler henüz tam olarak anlaşılır değil, bizim veri genler8biçimlenme ventral dorsal göz için rolleri vurgulamak.
Zebra balığı SOS çalışmaya bir mükemmel model organizmadır. Bir modeli sistem olarak bir çok göz geliştirme eğitim avantaj sağlar: omurgalı bir model; her nesil sergileyen yüksek verimlilik (~ 200 embriyo); genomunu tam olarak, hangi genetik manipülasyon kolaylaştırır sıralı; ve insan genlerinin yaklaşık % 70’i en az bir Zebra balığı orthologue, yapım o bir ideal genetik tabanlı modeli insan hastalık9,10. En önemlisi, onun gelişme dışarıdan anneye gerçekleşir ve onun larva göreceli kolaylığı11ile gelişmekte olan göz görselleştirme için sağlayan şeffaf,.
Bu iletişim kuralları kümesi içinde hangi aracılığıyla SOS Zebra balığı larva görselleştirildiği teknikleri açıklar. Bu raporda kullanılan görselleştirme teknikleri çeşitli sos sırasında normal göz kalkınma açık gözlem yanı sıra SOS kapatma hataları algılama yeteneğini sağlayacak. Bizim örnek protokolleri Gdf6 araştırmalar yer alacak, bir BMP dorsal için yerelleştirilmiş göz ve SOS kapatma bilinen regülatörü. Ayrıca, bu teknikleri genetik faktörler veya uygun SOS oluşumu ve kapatma etkiler farmakolojik ajanlar tanımlamak için deneysel manipülasyonlar ile kombine edilebilir. Ayrıca, biz deneyci SOS çevreleyen hücreleri morfolojik değişiklikler gözlemlemek izin veren bir protokol üzerinden mümkündür, tüm hücre zarlarında floresan görüntüleme dahil ettik. Amacımız bilimsel topluluk gelişmekte olan göz bu roman yapısı yeni görüşler sunmak için kullanılan standart iletişim kuralları kümesi oluşturmaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, standart bir dizi gelişmekte olan Zebra balığı embriyo SOS gözlemlemek için protokolleri mevcut. Kapatma gecikmesi fenotipleri belirlemek için bizim iletişim kuralları yeteneği göz choroid fissür kapatma gecikme görselleştirmek için kullanılan teknikler için benzer burun dorsal ve zamansal dorsal tarafında iki ayrı lobları ayrılması ayırt odaklı olması fenotipleri ventral gözünde.
Bu görselleştirme teknikleri inhibe veya rolleri SOS kapatılması içinde ç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser, arayan sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR), Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC), Alberta teknoloji Futures, yeniliklerin ve kadın ve çocuk sağlığı Araştırma Enstitüsü (WCHRI) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
- Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
