Visualizzazione del solco superiore oculare durante l'embriogenesi Danio rerio

La formazione dell’occhio dei vertebrati è un processo altamente conservato in cui vie di segnalazione intercellulare attentamente orchestrate stabilire i tipi di tessuto e specifica identità regionale¹. Perturbazioni alla morfogenesi occhio presto causare difetti profondi all’architettura dell’occhio e sono frequentemente accecante². Una tale malattia deriva dall’impossibilità di chiudere la fessura oculare coroidico nella parte ventrale della Coppa ottica³. Questo disturbo, noto come coloboma oculare, è stimato in 1 su 4-5000 nati vivi e causa 3-11% di cecità pediatrica, che si manifesta comunemente come una buco della serratura-come la struttura che sporge inferiorly dalla pupilla al centro dell’occhio^{4, 5,6}. La funzione della fenditura coroidico è di fornire un punto di ingresso per primi sistema vascolare in crescita nella tazza ottica, dopo di che i lati della fenditura fonderanno per racchiudere le navi⁷.

Mentre coloboma oculare è stata conosciuta fin dai tempi antichi, recentemente abbiamo identificato un sottogruppo romanzo di coloboma pazienti con perdita di tessuto che interessano la funzione superior/dorsale dell’occhio. Lavoro recente nel nostro laboratorio ha portato alla scoperta di una struttura oculare nell’occhio dorsale di zebrafish, che noi definiamo il solco superiore oculare (SOS) o fenditura superiore⁸. È importante notare che la struttura ha le caratteristiche di un solco e di una fessura. Simile a un solco, è uno strato di tessuto continuo che si estende dal nasale alla retina temporale. Inoltre, la chiusura della struttura non è mediata da una fusione tra i due opposti della membrana dello scantinato, e sembra che richiedono un processo morfogenetico da cui la struttura è popolata dalle cellule. Tuttavia, simile a una fenditura, forma una struttura che separa il lato nasale e temporale dell’occhio dorsale con la membrana dello scantinato. Per coerenza, si farà riferimento ad esso come SOS in questo testo.

Il SOS è evolutivamente conservato in vertebrati, essendo visibile durante la morfogenesi di occhio di pesce, pulcino, newt e mouse⁸. In contrasto con la fenditura coroidico, che è presente da 20-60 ore post-fertilizzazione (hpf) in zebrafish, il SOS è altamente temporaneo, essendo facilmente visibile da 20-23 hpf e assente da 26 hpf⁸. Recenti ricerche nel nostro laboratorio ha trovato che, simile alla fenditura coroidico, il SOS svolge un ruolo nell’orientamento vascolare durante occhio morfogenesi⁸. Anche se i fattori che controllano la formazione e la chiusura di SOS ancora completamente non sono capiti, i nostri dati ha fatto evidenziare ruoli per dorso-ventrale occhio patterning geni⁸.

Zebrafish è un organismo modello eccellente per studiare il SOS. Come sistema modello, fornisce una serie di vantaggi a studiare lo sviluppo dell’occhio: si tratta di un modello di vertebrati; ogni generazione esibisce alta fecondità (~ 200 embrioni); il suo genoma è stato completamente sequenziato, che facilita la manipolazione genetica; e circa il 70% dei geni umani hanno almeno un ortologo di zebrafish, rendendolo un ideale modello basato su genetica di malattia umana^9,10. La cosa più importante, lo sviluppo avviene esternamente alla madre, e le sue larve sono trasparenti, che consente la visualizzazione dell’occhio in via di sviluppo con relativa facilit๹.

In questa serie di protocolli, descriviamo le tecniche attraverso le quali il SOS possono essere visualizzati nelle larve di zebrafish. La varietà di tecniche di visualizzazione utilizzati in questo report vi permetterà chiara osservazione di SOS durante lo sviluppo normale dell’occhio, così come la capacità di rilevare difetti di chiusura SOS. I nostri protocolli di esempio saranno caratterizzato da indagini di Gdf6, un BMP localizzate alla dorsale occhio e noto regolatore di chiusura SOS. Ulteriormente, queste tecniche possono essere combinate con manipolazioni sperimentali per identificare fattori genetici o agenti farmacologici che influenzano la chiusura e la corretta formazione di SOS. Inoltre, abbiamo incluso un protocollo attraverso il quale è possibile, l’imaging fluorescente di tutte le membrane cellulari permettendo lo sperimentatore ad osservare i cambiamenti morfologici per le celle circostanti il SOS. Il nostro obiettivo è quello di stabilire un insieme di protocolli standardizzati che può essere utilizzato in tutta la comunità scientifica per offrire nuove prospettive in questo romanzo struttura dell’occhio in via di sviluppo.