Imagen de vesículas extracelulares mediante microscopía de fuerza atómica
Summary
Se describe un procedimiento paso a paso para la inmovilización sin etiquetas de exosomas y vesículas extracelulares a partir de muestras líquidas y sus imágenes mediante microscopía de fuerza atómica (AFM). Las imágenes AFM se utilizan para estimar el tamaño de las vesículas en la solución y caracterizar otras propiedades biofísicas.
Abstract
Los exosomas y otras vesículas extracelulares (EV) son complejos moleculares que consisten en una vesícula de membrana lipídica, su decoración superficial por proteínas de membrana y otras moléculas, y diverso contenido luminal heredado de una célula madre, que incluye ARN, proteínas y los ANN. La caracterización de los tamaños hidrodinámicos de los vehículos eléctricos, que depende del tamaño de la vesícula y su capa coronal formada por decoraciones superficiales, se ha convertido en rutina. Para los exosomas, el más pequeño de los vehículos eléctricos, la diferencia relativa entre los tamaños hidrodinámico y vesícula es significativa. La caracterización de los tamaños de las vesículas mediante la imagen de microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM), una técnica estándar de oro, sigue siendo un desafío debido al costo del instrumento, la experiencia necesaria para realizar la preparación de la muestra, la toma de imágenes y análisis de datos, y un pequeño número de partículas a menudo observadas en las imágenes. Una alternativa ampliamente disponible y accesible es la microscopía de fuerza atómica (AFM), que puede producir datos versátiles sobre geometría tridimensional, tamaño y otras propiedades biofísicas de las vesículas extracelulares. El protocolo desarrollado guía a los usuarios en la utilización de esta herramienta analítica y describe el flujo de trabajo para el análisis de vehículos eléctricos por el AFM, que incluye la preparación de muestras para la toma de imágenes de vehículos eléctricos en forma hidratada o desecada, la inmovilización electrostática de vesículas en un sustrato, adquisición de datos, su análisis e interpretación. Los resultados representativos demuestran que la fijación de los vehículos eléctricos en la superficie de mica modificada es predecible, personalizable y permite al usuario obtener resultados de tamaño para un gran número de vesículas. Se encontró que el tamaño de la vesícula basada en los datos de AFM era consistente con las imágenes crio-TEM.
Introduction
Las vesículas extracelulares (EV) están presentes en todos los fluidos corporales, incluyendo sangre, orina, saliva, leche y el líquido amniótico. Los exosomas forman una clase de distrito de vehículos eléctricos diferenciados de otros vehículos eléctricos por biogénesis endosomal, los marcadores de la vía endosomal y el tamaño más pequeño entre todos los vehículos eléctricos. El tamaño de los exosomas a menudo se notifica con una variabilidad sustancial entre los estudios. Se encontró que los resultados del tamaño dependían del método, lo que refleja la diferencia en los principios físicos empleados por diferentes técnicas analíticas para estimar los tamaños de EV1,2. Por ejemplo, el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA, por sus que la técnica de caracterización de tamaño más utilizada- estima el tamaño de los vehículos eléctricos como sus diámetros hidrodinámicos, que caracterizan la resistencia a la movilidad Browniana de los vehículos eléctricos en la solución. Un mayor diámetro hidrodinámico de una vesícula implica su menor movilidad en líquido. La capa coronal alrededor de las vesículas, que consiste en proteínas superficiales y otras moléculas ancladas o adsorbidas a la superficie de la membrana, impide sustancialmente la movilidad y aumenta el tamaño hidrodinámico de los vehículos eléctricos. En términos relativos, este aumento es particularmente grande para los exosomas3, como se ilustra en la Figura 1.
La microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM) es una técnica definitiva para caracterizar tamaños de vesículas y morfología en sus estados hidratados. Sin embargo, el alto costo de la instrumentación y la experiencia especializada necesaria para utilizarla motivan correctamente la exploración de técnicas alternativas que pueden crear imágenes de vehículos eléctricos hidratados. Un número relativamente pequeño de vehículos eléctricos observados o caracterizados en las imágenes crio-TEM adquiridas es otra desventaja notable de esta técnica.
La microscopía de fuerza atómica (AFM) visualiza la topografía tridimensional de los vehículos eléctricos hidratados o desecados4,5,6 mediante el escaneo de una sonda a través del sustrato para rasterar la imagen de las partículas en la superficie. En este estudio se describen los pasos esenciales del protocolo para caracterizar los vehículos eléctricos de AFM. Antes de tomar imágenes de las vesículas en líquido, deben ser inmovilizadas sobre un sustrato, ya sea amarre a una superficie funcionalizada, atrapando en un filtro, o por atracción electrostática7. La fijación electrostática en un sustrato cargado positivamente es una opción particularmente conveniente para la inmovilización de exosomas conocidos por tener un potencial zeta negativo. Sin embargo, las mismas fuerzas electrostáticas que inmovilizan las vesículas extracelulares en la superficie también distorsionan su forma, lo que hace que el análisis de datos post-imágenes sea esencial. Elaboramos este punto describiendo el algoritmo que estima el tamaño de las vesículas globulares en la solución basada en los datos de AFM sobre la forma distorsionada de los exosomas inmovilizados en la superficie.
En el protocolo desarrollado, se presenta el procedimiento para la robusta inmovilización electrostática de vesículas y seguido de los pasos necesarios para realizar imágenes de fuerza atómica en los estados hidratados o desecados. Se identifican los factores que influyen en la concentración superficial de las vesículas inmovilizadas. La guía se da sobre cómo realizar la inmovilización electrostática para muestras con diferentes concentraciones de vehículos eléctricos en la solución. Se discute la selección de condiciones experimentales que permiten la estimación de distribuciones de probabilidad empírica de diferentes propiedades biofísicas basadas en un número suficientemente grande de vesículas inmovilizadas. Se proporcionan ejemplos de análisis post-imagen de los datos de AFM. Específicamente, se describe un algoritmo para determinar el tamaño de las vesículas en la solución basada en la caracterización AFM de los vehículos eléctricos inmovilizados. Los resultados representativos muestran la consistencia del tamaño de la vesícula por AFM con los resultados de la imagen crio-TEM.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inmovilización de los vehículos eléctricos de un fluido biológico, el escaneo de superficies y el análisis de imágenes son los pasos esenciales del protocolo desarrollado para la caracterización AFM de los vehículos eléctricos en líquido. El número de vesículas susceptibles a las escalas de imágenes AFM con el área de superficie de la imagen y la concentración superficial de las vesículas inmovilizadas en el sustrato. Dado un potencial zeta negativo de vehículos eléctricos y exosomas<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el apoyo financiero de la National Science Foundation (número de premio IGERT-0903715), la Universidad de Utah (Departamento de Ingeniería Química Y el Premio de Becas de Investigación de Posgrado), y el Instituto de Ciencias de Skolkovo tecnología (Beca Skoltech).
Materials
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
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