Imaging van extracellulaire vesicles door Atoom kracht microscopie
Summary
Een stapsgewijze procedure wordt beschreven voor het label vrij immobilisatie van exosomen en extracellulaire blaasjes uit vloeibare monsters en hun beeldvorming door Atoom kracht microscopie (AFM). De AFM-beelden worden gebruikt om de grootte van de blaasjes in de oplossing te schatten en andere biofysische eigenschappen te karakteriseren.
Abstract
Exosomen en andere extracellulaire blaasjes (Ev’s) zijn moleculaire complexen bestaande uit een vesikel van het lipide membraan, de oppervlakte-inrichting door membraan eiwitten en andere moleculen, en diverse Luminale inhoud geërfd van een bovenliggende cel, waaronder Rna’s, eiwitten en Dna’s. De karakterisering van de hydrodynamische maten van EVs, die afhangt van de grootte van het vesikel en de coronale laag gevormd door oppervlakte decoraties, is routine geworden. Voor exosomen, de kleinste van EVS, is het relatieve verschil tussen de hydrodynamische en blaasjes maten significant. De karakterisering van blaasjes-maten door de cryogene transmissie elektronenmicroscopie (cryo-TEM) beeldvorming, een gouden standaardtechniek, blijft een uitdaging als gevolg van de kosten van het instrument, de expertise die nodig is om de monstervoorbereiding, beeldvorming en gegevensanalyse en een klein aantal deeltjes die vaak in beelden worden waargenomen. Een algemeen beschikbaar en toegankelijk alternatief is de atomaire kracht microscopie (AFM), die veelzijdige gegevens kan produceren over driedimensionale geometrie, grootte en andere biofysische eigenschappen van extracellulaire blaasjes. Het ontwikkelde protocol begeleidt de gebruikers bij het gebruik van deze analytische tool en schetst de workflow voor de analyse van EVs door de AFM, die de monstervoorbereiding voor beeldvormings EVs in gehydrateerde of gedroogde vorm omvat, de elektrostatische immobilisatie van blaasjes op een substraat, data-acquisitie, analyse en interpretatie. De representatieve resultaten tonen aan dat de fixatie van EVs op het gemodificeerde mica-oppervlak voorspelbaar, aanpasbaar is en de gebruiker in staat stelt om dimensionerings resultaten te verkrijgen voor een groot aantal blaasjes. De blaasje dimensionering op basis van de AFM gegevens bleek consistent te zijn met de cryo-TEM Imaging.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (Ev’s) zijn aanwezig in alle lichaamsvloeistoffen, waaronder bloed, urine, speeksel, melk en het vruchtwater. Exosomes vormen een districts klasse van EVs, onderscheiden van andere EVs door endosomale biogenese, de markers van het endosomale traject en de kleinste grootte onder alle Ev’s. De grootte van exosomen wordt vaak gerapporteerd met een aanzienlijke variabiliteit tussen studies. De dimensionerings resultaten bleken methode afhankelijk te zijn, wat het verschil in fysische principes weerspiegelt dat door verschillende analytische technieken wordt gebruikt om de EV-grootten1,2teschatten. De nanodeeltjes Tracking Analysis (NTA)-de meest gebruikte maat karakterisatie techniek-schat de grootte van EVS als hun hydrodynamische diameters, die kenmerkend zijn voor de weerstand tegen de Brownische mobiliteit van EVS in de oplossing. Een grotere hydrodynamische diameter van een vesikel impliceert zijn lagere mobiliteit in vloeistof. De coronale laag rond blaasjes, bestaande uit oppervlakte eiwitten en andere moleculen die aan het membraanoppervlak zijn verankerd of geadsord, belemmert de mobiliteit aanzienlijk en vergroot de hydrodynamische grootte van Ev’s. In relatieve termen is deze toename bijzonder groot voor de exosomen3, zoals geïllustreerd in Figuur 1.
De cryogene transmissie elektronenmicroscopie (cryo-TEM) beeldvorming is een definitieve techniek in het karakteriseren van blaasje maten en morfologie in hun gehydrateerde toestanden. Echter, de hoge kosten van de instrumentatie en de gespecialiseerde expertise die nodig zijn om het correct te gebruiken motiveren de verkenning van alternatieve technieken die kunnen beeld gehydrateerd EVs. Een relatief klein aantal EVs waargenomen of gekarakteriseerd in de verworven cryo-TEM beelden is een ander opmerkelijk nadeel van deze techniek.
Atomaire kracht microscopie (AFM) visualiseert de driedimensionale topografie van gehydrateerde of gedroogde ev’s4,5,6 door een sonde over het substraat te scannen om het beeld van de deeltjes op het oppervlak te rasterlen. De essentiële stappen van het protocol om EVs door de AFM te karakteriseren, worden in deze studie uiteengezet. Voordat de blaasjes in vloeistof worden gevisualiseerd, moeten ze worden geïmmobiliseerd op een substraat door ofwel Tethering aan een Gefunctionaliseerde oppervlak, overvulling in een filter, of door elektrostatische aantrekkingskracht7. De elektrostatische fixatie op een positief geladen substraat is een bijzonder handige optie voor immobilisatie van exosomen waarvan bekend is dat ze een negatief Zeta-potentieel hebben. Echter, dezelfde elektrostatische krachten die de extracellulaire blaasjes op het oppervlak immobiliseren, verstoren ook hun vorm, wat post-Imaging data-analyse essentieel maakt. We hebben dit punt uitgewerkt door het algoritme te beschrijven dat de grootte van de bolvormige blaasjes in de oplossing schat op basis van de gegevens van de AFM over de vervormde vorm van de exosomen geïmmobiliseerd op het oppervlak.
In het ontwikkelde protocol wordt de procedure voor de robuuste elektrostatische immobilisatie van blaasjes gepresenteerd en gevolgd door de stappen die nodig zijn om atoom kracht imaging in de gehydrateerde of drooghoudende toestanden uit te voeren. De factoren die invloed hebben op de oppervlakte concentratie van de geïmmobiliseerde blaasjes worden geïdentificeerd. De leiding wordt gegeven over het uitvoeren van de elektrostatische immobilisatie voor monsters met verschillende concentraties van EVs in de oplossing. De selectie van experimentele omstandigheden die de raming van empirische kansverdelingen van verschillende biofysische eigenschappen, gebaseerd op een voldoende groot aantal geïmmobiliseerde blaasjes, wordt besproken. Voorbeelden van post-Imaging analyse van de AFM-gegevens worden gegeven. Specifiek, een algoritme wordt beschreven voor het bepalen van de grootte van blaasjes in de oplossing op basis van de AFM karakterisatie van geïmmobiliseerde EVs. De representatieve resultaten tonen de consistentie van de blaasje dimensionering door de AFM met de resultaten van cryo-TEM Imaging.
Protocol
Representative Results
Discussion
De immobilisatie van EVs uit een biologische vloeistof, oppervlakte scanning en beeldanalyse zijn de essentiële stappen van het ontwikkelde protocol voor de AFM-karakterisering van Ev’s in vloeistof. Het aantal blaasjes vatbaar voor AFM beeld schalen met het oppervlak van de afbeelding en de oppervlakte concentratie van de blaasjes geïmmobiliseerd op het substraat. Gezien een negatief Zeta-potentieel van ev’s en exosomen18, pleiten we voor elektrostatische fixatie van EVS van vloeibare monsters …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen financiële steun van de National Science Foundation (Award Number IGERT-0903715), de Universiteit van Utah (afdeling Chemical Engineering Seed Grant en de Graduate Research Fellowship Award), en Skolkovo Institute of Science en technologie (Skoltech Fellowship).
Materials
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
References
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
- Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
- Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
- Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
- Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
- Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
- Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
- Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
- Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
- Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
- Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
- Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
- Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
- Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
- Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
- Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
- Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
- van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).
