تصوير الحويصلات خارج الخلية عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية
Summary
يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لشل الحركة الخالية من الملصقات من الحويصلات الخارجية والحويصلات خارج الخلية من العينات السائلة وتصويرها عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM). وتستخدم الصور AFM لتقدير حجم الحويصلات في الحل وتميز الخصائص البيوفيزيائية الأخرى.
Abstract
إكسوسومات وغيرها من الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي المجمعات الجزيئية تتكون من حويصلة غشاء الدهون، والديكور السطحي من قبل بروتينات الغشاء والجزيئات الأخرى، والمحتوى الإنارة المتنوعة الموروثة من الخلية الأم، والتي تشمل RNAs، البروتينات، وDNAs. وقد أصبح توصيف الأحجام الهيدرودينامية للمركبات الكهربائية، الذي يعتمد على حجم الحويصلة وطبقته الإكليلية التي تشكلها الزخارف السطحية، أمرا روتينيا. بالنسبة للاكسوسوسوم، أصغر المركبات الكهربائية، الفرق النسبي بين أحجام الهيدروديناميكا والحويصلات كبير. ولا يزال توصيف أحجام الحويصلات بواسطة التصوير المجهري الإلكتروني للإرسال المبرد (cryo-TEM)، وهو تقنية قياسية ذهبية، يشكل تحدياً بسبب تكلفة الأداة، والخبرة المطلوبة لإجراء إعداد العينة، والتصوير، و تحليل البيانات، وعدد قليل من الجسيمات التي غالبا ما لوحظت في الصور. وثمة بديل متاح على نطاق واسع ويمكن الوصول إليه هو الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM)، الذي يمكن أن ينتج بيانات متعددة الاستخدامات عن الهندسة ثلاثية الأبعاد، والحجم، وغيرها من الخصائص الفيزيائية الحيوية للحويصلات خارج الخلية. ويرشد البروتوكول المطور المستخدمين في استخدام هذه الأداة التحليلية ويحدد سير العمل لتحليل المركبات الكهربائية من قبل AFM، والذي يتضمن إعداد عينة لتصوير المركبات الكهربائية في شكل رطب أو المجففة، والجمود الكهروستاتيكي لل الحويصلات على الركيزة، والحصول على البيانات، وتحليلها، والتفسير. وتبين النتائج التمثيلية أن تثبيت المركبات الكهربائية على سطح الميكا المعدل يمكن التنبؤ به، ويمكن تخصيصه، ويسمح للمستخدم بالحصول على نتائج تغيير الحجم لعدد كبير من الحويصلات. وقد تبين أن تغيير حجم الحويصلة استنادا إلى بيانات AFM يتسق مع التصوير بالتبريد- TEM.
Introduction
توجد الحويصلات خارج الخلية (EVs) في جميع سوائل الجسم، بما في ذلك الدم والبول واللعاب والحليب والسائل السلوي. تشكل Exosomes فئة منطقة من المركبات الكهربائية المتمايزة عن المركبات الكهربائية الأخرى عن طريق التكوين الحيوي الأنبي، وعلامات المسار الأنبي، وأصغر حجم بين جميع المركبات الكهربائية. وكثيرا ً ما يتم الإبلاغ عن حجم الاكسوسوسوم مع تباين كبير بين الدراسات. تم العثور على نتائج التحجيم لتكون تعتمد على طريقة، مما يعكس الفرق في المبادئ المادية المستخدمة من قبل تقنيات تحليلية مختلفة لتقدير أحجام EV1،2. على سبيل المثال، يقدر تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) – وهو تقنية توصيف الحجم الأكثر استخداماً – حجم المركبات الكهربائية كأقطار هاديدينامية، والتي تميز مقاومة حركة البراونيان للمركبات الكهربائية في الحل. قطر هيدرودينامي أكبر من الحويصلة ينطوي على انخفاض حركتها في السائل. الطبقة الإكليلية حول الحويصلات، تتكون من البروتينات السطحية والجزيئات الأخرى الراسية أو الممتزة على سطح الغشاء، تعيق إلى حد كبير التنقل وتزيد من الحجم الهيدرودينامي للمركبات الكهربائية. ومن الناحية النسبية، فإن هذه الزيادة كبيرة بشكل خاص بالنسبة للإكسوسوم3، كما هو موضح في الشكل 1.
التصوير المجهري الإلكتروني للإرسال المبرد (CRYO-TEM) هو تقنية نهائية في تحديد أحجام الحويصلات ومورفولوجيا في حالاتها المرطبة. ومع ذلك، فإن التكلفة العالية للأجهزة والخبرة المتخصصة اللازمة لاستخدامها بشكل صحيح تحفيز استكشاف التقنيات البديلة التي يمكن أن تصور المركبات الكهربائية رطب. وهناك عدد صغير نسبيا من المركبات الكهربائية التي لوحظت أو تتميز في الصور المكتسبة بالتبريد TEM هو عيب ملحوظ آخر من هذه التقنية.
تصور مجهرية القوة الذرية (AFM) الطوبوغرافيا ثلاثية الأبعاد للمركبات الكهربائية المرطبة أو المجففة4و5و6عن طريق مسح مسبار عبر الركيزة لتنقيط صورة الجسيمات على السطح. وترد في هذه الدراسة الخطوات الأساسية للبروتوكول الذي يميز المركبات الكهربائية من جانب AFM. قبل تصوير الحويصلات في السائل، يجب أن تكون معطلة على الركيزة إما عن طريق الربط إلى سطح وظيفي، ومحاصرة في مرشح، أو عن طريق الجذب الكهروستاتيكي7. التثبيت الكهروستاتيكي على الركيزة المشحونة بشكل إيجابي هو خيار مناسب بشكل خاص لشل من exosomes المعروف أن لديها إمكانات زيتا سلبية. ومع ذلك، فإن نفس القوى الكهروستاتيكية التي تعطل الحويصلات خارج الخلية على السطح تشوه أيضا شكلها، مما يجعل تحليل البيانات بعد التصوير ضروريًا. نقوم بتفصيل هذه النقطة من خلال وصف الخوارزمية التي تقدر حجم الحويصلات الكروية في الحل استناداً إلى بيانات AFM على الشكل المشوه للاكسوسوم اتّبأ على السطح.
في البروتوكول المطور، يتم عرض إجراء تجميد الحويصلات الكهروستاتيكي القوي، وتليه الخطوات اللازمة لإجراء تصوير القوة الذرية في الدول المرطبة أو المجففة. يتم تحديد العوامل التي تؤثر على التركيز السطحي للحويصلات المعطلة. وتُعطى الإرشادات بشأن كيفية إجراء عملية التعطيل الكهروستاتيكي للعينات ذات التركيزات المختلفة للمركبات الكهربائية في الحل. ويناقش اختيار الظروف التجريبية التي تسمح بتقدير توزيعات الاحتمالات التجريبية لمختلف الخصائص البيوفيزيائية استنادا إلى عدد كبير بما فيه الكفاية من الحويصلات المعطلة. وترد أمثلة على تحليل ما بعد التصوير لبيانات AFM. وعلى وجه التحديد، يتم وصف خوارزمية لتحديد حجم الحويصلات في الحل استناداً إلى توصيف AFM للمركبات الكهربائية المعطلة. وتظهر النتائج التمثيلية اتساق التحجيم الحويصلة من قبل AFM مع نتائج التصوير بالتبريد TEM.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن تجميد المركبات الكهربائية من سائل بيولوجي، ومسح سطحي، وتحليل الصور هي الخطوات الأساسية للبروتوكول المطور لتوصيف AFM للمركبات الكهربائية في السائل. عدد الحويصلات القابلة لموازين التصوير AFM مع المساحة السطحية المصورة والتركيز السطحي للحويصلات المعطلة على الركيزة. نظرا لإمكانات زيتا ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وينوه المؤلفون بالدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم (رقم الجائزة IGERT-0903715)، وجامعة يوتا (منحة بذور الهندسة الكيميائية وجائزة زمالة بحوث الدراسات العليا)، ومعهد سكولكوفو للعلوم والتكنولوجيا (زمالة سكولتيك).
Materials
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
References
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
- Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
- Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
- Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
- Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
- Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
- Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
- Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
- Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
- Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
- Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
- Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
- Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
- Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
- Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
- Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
- Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
- van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).
