Método de preparación de muestras de microscopio electrónico de escaneo y transmisión para los apéndices del escarabajo carpintero
Summary
Con el fin de observar la ultraestructura de los insectos sensilla, se presentó en el estudio el protocolo de preparación de muestras de escaneo y transmisión electrónica (SEM y TEM, respectivamente). Se añadió Tween 20 en el fijador para evitar la deformación de la muestra en SEM. La microscopía de fluorescencia fue útil para mejorar la precisión del corte en TEM.
Abstract
Este informe describió métodos de preparación de muestras que escanear y transmisión observaciones del microscopio electrónico, demostrado mediante la preparación de apéndices del escarabajo carpintero de madera, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), para ambos tipos de microscopía electrónica. El protocolo de preparación de muestras de microscopía electrónica de barrido (SEM) se basó en la fijación química de la muestra, la deshidratación en una serie de baños de etanol, el secado y el recubrimiento de esputo. Al añadir Tween 20 (Laurato de sorbitano de polioxietileno) al fijador y a la solución de lavado, la superficie del cuerpo de insectos del escarabajo carpintero se lavó más limpiamente en SEM. La preparación de muestras de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de este estudio implicó una serie de pasos que incluyen fijación, deshidratación de etanol, incrustación en resina, posicionamiento mediante microscopía de fluorescencia, seccionamiento y tinción. Fixative con Tween 20 habilitado penetrar la pared del cuerpo del insecto de escarabajo de madera más fácilmente de lo que habría sido sin Tween 20, y posteriormente mejores tejidos fijos y órganos en el cuerpo, lo que produjo claras observaciones del microscopio electrónico de transmisión de insectos sensilla ultraestructuras. El siguiente paso de esta preparación fue determinar las posiciones de la sensilla de insectos en la muestra incrustada en el bloque de resina mediante el uso de microscopía de fluorescencia para aumentar la precisión del posicionamiento de la sensilla objetivo. Esta precisión de corte mejorada.
Introduction
La microscopía electrónica de barrido es una herramienta importante en muchos estudios morfológicos, que SEM muestra las estructuras superficiales1,2. El atractivo de la microscopía electrónica de transmisión es que se puede utilizar para estudiar una amplia gama de estructuras biológicas a escala nanométrica, desde la arquitectura de las células y la ultraestructura de los orgánulos, hasta la estructura de complejos macromoleculares y proteínas. TEM muestra las estructuras internas3,4,5.
Coleoptera es el grupo más grande de insectos, incluyendo alrededor de 182 familias y 350.000 especies. La mayoría de los insectos coleopterantes, en particular los escarabajos carpinteros, se alimentan de plantas, muchas de las cuales son plagas importantes de bosques y árboles frutales, causando daños devastadores a los árboles6. En la actualidad, la población de prevención y control de plagas basada en la teoría de la ecología química ha recibido una atención cada vez mayor7. Los métodos de control de feromonas eficientes, bajos en tóxicos y libres de contaminación se han convertido en un camino eficaz8. El estudio de la morfología de la sensilla y la ultraestructura de los insectos es una parte importante de la investigación de la ecología química de los insectos. La microscopía electrónica de escaneo y transmisión (SEM y TEM, respectivamente) se utilizan con gran efecto para estudiar su morfología y anatomía interna. Sin embargo, durante la preparación de muestras de insectos para microscopía electrónica (EM), la objetividad y autenticidad del sitio de observación puede verse afectada9. En general, la preparación de muestras SEM de insectos requiere limpieza, fijación de tejidos, deshidratación, metatesis, secado y recubrimiento de esputo10. Debido al complejo entorno en el que vive el escarabajo carpintero, la superficie del cuerpo a menudo tiene varios contaminantes y sus apéndices a menudo tienen muchas sensillas finas largas o cerdas. En particular, algunos woodborers no están disponibles en la cría de laboratorio, que se recoge directamente en el campo, y luego se colocan en el fluido de fijación para garantizar la frescura y posteriormente lavado en el laboratorio. Si la muestra se fija primero y luego se lava, obviamente es mucho más difícil eliminar los desechos porque el glutaraldehído lo fija fuertemente a la muestra. Tween 20 es un tensioactivo11,12,13,14, que desempeña un papel importante en el proceso de lavado, incluyendo la reducción de la tensión superficial del agua y la mejora de la humectabilidad del agua en la superficie de la ropa. En este estudio, Tween 20 se añadió a la solución de fijación y la solución de limpieza PBS para reducir la tensión superficial del líquido, y evitar que la suciedad se deposite en la superficie del cuerpo del escarabajo de madera, lo que hizo que la superficie del cuerpo fuera más limpia en SEM.
Usando TEM, sensilla en diferentes órganos de insectos se puede cortar para revelar las estructuras claras dentro de ellos, proporcionando así una base para analizar las funciones de sensilla. Cuando el insecto sujeto, como el escarabajo carpintero, es grande, y su pared corporal tiene un grado sustancial de esclerotización, por lo que el fijador puede no saturar completamente los tejidos de órganos dentro del cuerpo del insecto. Tween 20 puede mejorar la dispersión y la capacidad de suspensión de la suciedad. En este estudio, Tween 20 se añadió al fijador para mejorar la penetración de fluido fijador en la pared del cuerpo del insecto del escarabajo carpintero, evitando la deformación y el colapso del epidermi11,12,13. Además, utilizando la tecnología de corte general, es difícil localizar con precisión diferentes tipos de sensilla, en particular para algunas sensillaspequeñas 15. Basado en la preparación tradicional de muestras TEM, este estudio combinó la microscopía de fluorescencia y SEM para determinar la posición de la sensilla de insectos en el bloque incrustado, mejorando así la precisión del corte.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, presentamos un esquema de preparación de muestras para escanear y transmisión de microscopía electrónica para el escarabajo carpintero. Utilizando el apéndice de insectos como sujeto de estudio representativo, demostramos varias mejoras con respecto a los métodos tradicionales de preparación de muestras.
El aceite líquido separado de la superficie sólida se emulsiona en pequeñas gotas, que pueden ser bien dispersadas y suspendidas en el medio de lavado para reducir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos la generosa asistencia del Colegio Vocacional de Agricultura de Beijing, el Instituto para la Aplicación de la Energía Atómica (Academia China de Ciencias Agrícolas), el Centro de Bioinvestigación de la Universidad Forestal de Beijing y el Profesor Shan-gan Zhang del Instituto de Zoología, Academia China de Ciencias. Esta investigación fue apoyada por el Programa Nacional Clave de I+D de China (2017YFD0600103), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 31570643, 81774015), Forest Scientific Research in the Public Welfare of China (201504304), Mongolia Interior Plan de inicio de investigación de talento de alto nivel de la Universidad Agrícola (203206038), y proyecto de investigación de educación superior de la región autónoma de Mongolia Interior (NJZZ18047), Inner Mongolia Autonomous Region Linxue “Double First-class” Construction Project (170001).
Materials
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
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