Esempio di metodo di preparazione del microscopio elettronico di scansione e trasmissione per le appendici di Woodboring Beetle

La microscopia elettronica a scansione è uno strumento importante in molti studi di morfologia, che SEM mostra le strutture superficiali^1,2. L’appeal della microscopia elettronica a trasmissione è che può essere utilizzata per studiare un’ampia gamma di strutture biologiche su scala nanometrica, dall’architettura delle cellule e l’ultrastruttura degli organelli, alla struttura dei complessi macromolecolari e delle proteine. TEM mostra le strutture interne^3,4,5.

Coleoptera è il più grande gruppo di insetti, tra cui circa 182 famiglie e 350.000 specie. La maggior parte degli insetti coleopteraran, in particolare il coleottero che si nutre di piante, molte delle quali sono importanti parassiti di foreste e alberi da frutto, causando danni devastanti agli alberi⁶. Attualmente, la prevenzione e il controllo della popolazione di parassiti basati sulla teoria dell’ecologia chimica hanno ricevuto una crescente attenzione⁷. Metodi di controllo dei feromone efficienti, a basso tossico e privo di inquinamento sono diventati un modo efficace^{per 8}. Studiare la morfologia della sensilla e l’ultrastruttura degli insetti è una parte importante della ricerca sull’ecologia chimica degli insetti. La microscopia elettronica a scansione e trasmissione (rispettivamente SEM e TEM) viene utilizzata con grande effetto per studiarne la morfologia e l’anatomia interna. Tuttavia, durante la preparazione di campioni di insetti per la microscopia elettronica (EM), l’obiettività e l’autenticità del sito di osservazione possono essere influenzate⁹. In generale, la preparazione del campione SEM degli insetti richiede pulizia, fissazione dei tessuti, disidratazione, metatesi, essiccazione e rivestimento sputter¹⁰. A causa dell’ambiente complesso in cui vivono coleotteri in legno, la superficie del corpo ha spesso vari inquinanti e le loro appendici hanno spesso molti sensi o setole lunghe e fini. In particolare, alcuni boscaioli non sono disponibili dall’allevamento di laboratorio, che ha raccolto direttamente sul campo, per poi mettere in liquido di fissaggio per garantire freschezza e successivamente lavati in laboratorio. Se il campione viene prima fissato e poi lavato, ovviamente è molto più difficile rimuovere i detriti perché la glutaraldeide lo fissa fortemente al campione. Tween 20 è un surfactant^11,12,13,14, che svolge un ruolo importante nel processo di lavaggio, tra cui la riduzione della tensione superficiale dell’acqua e il miglioramento della umidità dell’acqua sulla superficie del bucato. In questo studio, Tween 20 è stato aggiunto alla soluzione di fissaggio e alla soluzione di pulizia PBS per ridurre la tensione superficiale del liquido e impedire che lo sporco si depositi sulla superficie del corpo del coleottero che lavora, il che ha reso la superficie del corpo più pulita in SEM.

Utilizzando TEM, la sensilla su diversi organi di insetti può essere tagliata per rivelare le strutture chiare al loro interno, fornendo così una base per l’analisi delle funzioni di sensilla. Quando l’insetto soggetto, come il coleottero che lavora nel legno, è grande e la sua parete del corpo ha un notevole grado di sclerotizzazione, quindi il fissativo potrebbe non saturare completamente i tessuti dell’organo all’interno del corpo dell’insetto. Il Tween 20 può migliorare la dispersione e la capacità di sospensione dello sporco. In questo studio, Tween 20 è stato aggiunto al fissativo per migliorare la penetrazione del fluido fissativo nella parete del corpo dell’insetto dello scarabeo legnoso, evitando la deformazione e il collasso dell’epidermi^11,12,13. Inoltre, utilizzando la tecnologia generale di affettatura, è difficile individuare con precisione diversi tipi di sensilla, in particolare per qualche piccola sensilla¹⁵. Basato sulla preparazione tradizionale del campione TEM, questo studio ha combinato la microscopia a fluorescenza e il SEM per determinare la posizione della sensilla degli insetti nel blocco incorporato, migliorando così la precisione di affettare.