הכנה לדוגמה שיטת סריקה ומיקרוסקופ אלקטרון שידור לתוספות של החיפושית המשעממת
Summary
כדי להתבונן במבנה האולטרסאונד של מבנה החרקים, סריקה והעברה של מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM ו-TEM, בהתאמה) פרוטוקול הכנה לדוגמה הוצגו במחקר. יצירת רצף 20 נוספה לתוך התיקונים כדי למנוע דפורמציה לדוגמה ב-SEM. מיקרוסקופ פלואורסצנטית היה מועיל לשיפור דיוק חיתוך ב TEM.
Abstract
דו ח זה תיאר שיטות הכנה למדגם שסורקים ומשנים תצפיות מיקרוסקופ אלקטרונים, הפגינו על ידי הכנת תוספות של חיפושית היער המשעמם, כלוראופורוס caragana Xie &Amp; וואנג (2012), עבור שני סוגים של מיקרוסקופ אלקטרוני. סריקת המיקרוסקופ אלקטרון (SEM) לדוגמה הפרוטוקול היתה מבוססת על קיבוע כימי לדוגמה, התייבשות בסדרה של אמבטיות אתנול, ייבוש, וציפוי sputter. על ידי הוספת רצף 20 (Polyoxyethylene ביתן לוראט) לפתרון התיקונים והשטיפה, משטח גוף החרק של חיפושית הוודנית נשטף ביותר בתוך SEM. שידור זה של המחקר של אלקטרון מיקרוסקופ (TEM) לדוגמה הכנה מעורב סדרה של שלבים כולל קיבעון, התייבשות אתנול, הטבעה שרף, מיצוב באמצעות מיקרוסקופ הזריחה, הצבת, ו כתמים. מתוקן עם רצף 20 זמין לחדור את קיר גוף החרק של חיפושית משעממת בקלות רבה יותר מאשר היה להיות ללא רצף 20, ולאחר מכן רקמות קבועות יותר ואיברים בגוף, ובכך הניב ברור שידור אלקטרון תצפיות מיקרוסקופ של חרק sensilla מבנים. השלב הבא של הכנה זו היה לקבוע את המיקומים של sensilla חרק במדגם מוטבע בלוק שרף באמצעות מיקרוסקופ הזריחה כדי להגדיל את הדיוק של מיצוב היעד sensilla. דיוק זה לחתוך משופר.
Introduction
סריקת מיקרוסקופ אלקטרון הוא כלי חשוב במחקרים מורפולוגיה רבים, SEM מראה מבנים פני השטח1,2. הערעור של המיקרוסקופיה האלקטרונים הוא שניתן להשתמש בו כדי ללמוד מגוון רחב של מבנים ביולוגיים בסולם הננו, מארכיטקטורת התאים ומבנה האולטרהאורגלים, למבנה של מכלולי macromolecular וחלבונים. TEM מראה מבנים פנימיים3,4,5.
Coleoptera היא הקבוצה הגדולה ביותר של חרקים, כולל כ 182 משפחות ו 350,000 מינים. רוב החרקים המתקוטנים, בחיפושית משעממת במיוחד, ניזונים מצמחים, שרבים מהם הם מזיקים חשובים של יערות ועצי פרי, דבר הגורם לנזק הרסני לעצים6. כיום, אוכלוסיית המניעה והבקרה של המזיקים המבוססת על תיאוריית האקולוגיה הכימית קיבלה את תשומת הלב הגוברת7. יעיל, נמוך, רעיל, מזהמים ללא זיהום שיטות שליטה הפכו להיות דרך יעילה8. לימוד המבנה הסגילה ומבנה האולטרסאונד של החרקים הוא חלק חשוב ממחקר האקולוגיה הכימית של החרקים. מיקרוסקופ אלקטרוני סריקה והעברה (SEM ו-TEM, בהתאמה) משמשים להשפעה רבה כדי ללמוד את המבנה שלהם ואת האנטומיה הפנימית. עם זאת, במהלך הכנת דגימות חרקים עבור מיקרוסקופ אלקטרוני (EM), האובייקטיביות והאותנטיות של אתר התצפית עשויים להיות מושפעים9. באופן כללי, הכנת SEM לדוגמה של חרקים דורש ניקוי, קיבוע רקמות, התייבשות, מטאמתזה, ייבוש, ציפוי sputter אטר10. בשל הסביבה המורכבת שבה החיפושית המשעממת חיה, משטח הגוף לעתים קרובות יש מזהמים שונים והתוספות שלהם לעתים קרובות יש הרבה sensilla ארוך ומשובח או זיפים. בפרט, חלק מהעצים אינם זמינים מגידול במעבדה, שנאסף ישירות בתחום, ולאחר מכן הכניסו לתיקון נוזלים כדי להבטיח רעננות ולאחר מכן נשטפו במעבדה. אם המדגם הוא קבוע הראשון ולאחר מכן שטף, ברור שזה הרבה יותר קשה להסיר את הפסולת כי glutarאלדהיד מאוד מתקן אותו למדגם. מפעיל 20 הוא מעין משטח של11,12,13,14, אשר ממלא תפקיד חשוב בתהליך השטיפה, כולל הפחתת מתח הפנים של המים ושיפור הווטביליות של מים על פני הכביסה. במחקר זה, רצף 20 נוספה לפתרון תיקון ופתרון ניקוי PBS כדי להפחית את המתח פני השטח של הנוזל, ולמנוע את הלכלוך מפני הפקדת על משטח הגוף של חיפושית משעממת, אשר עשה את הגוף המנקה משטח ב-SEM.
באמצעות TEM, sensilla על איברים שונים של חרקים ניתן לחתוך כדי לחשוף את מבנים ברורים בתוכם, ובכך לספק בסיס לניתוח פונקציות sensilla. כאשר חרק הנושא, כגון חיפושית משעממת, גדול, ולקיר הגוף שלה יש מידה ניכרת של sclerotization, כך הקיבעון לא יכול למלא רקמות איברים בתוך גוף החרק. רצף 20 יכול לשפר את הפיזור ואת היכולת ההשעיה של הלכלוך. במחקר זה, רצף 20 נוספה כדי קבע כדי לשפר חדירה נוזל קבע לתוך קיר גוף החרק של חיפושית משעממת, הימנעות דפורמציה והתמוטטות של epidermi11,12,13. בנוסף, באמצעות טכנולוגיה כללית לחתוך, קשה לאתר במדויק סוגים שונים של sensilla, במיוחד עבור כמה sensilla קטן15. מבוסס על הכנה לדוגמה המסורתית TEM, מחקר זה משולב מיקרוסקופ זריחה ו-SEM כדי לקבוע את המיקום של sensilla חרק בבלוק מוטבע, ובכך לשפר את דיוק החיתוך.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, הצגנו ערכת הכנה לדוגמה לסריקת והעברת מיקרוסקופ אלקטרוני לחיפושית משעממת. השימוש בנספח החרקים כנושא מחקר מייצג, הדגמנו מספר שיפורים בשיטות ההכנה לדוגמה המסורתית.
השמן הנוזלי המנוקל מפני השטח המוצק הוא תחליב לטיפות קטנות, שיכול להיות מפוזר היטב ומושעה במדיום הכביס…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מעריכים את הסיוע הנדיב של המכללה התעסוקתית של בייג לחקלאות, המכון ליישום של אנרגיה אטומית (האקדמיה הסינית למדע החקלאי), מרכז המחקר Bioresearch אוניברסיטת בייג יערנות ופרופסור שאן-גן ג’אנג המכון לזואולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית הלאומית של מפתח R & D של סין (2017YFD0600103), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (גרנט No. 31570643, 81774015), יער מחקר מדעי ברווחה הציבורית של סין (201504304), מונגוליה הפנימית האוניברסיטה החקלאית ברמה גבוהה מחקר כשרונות תוכנית אתחול (203206038), והאזור האוטונומי של מונגוליה הפנימית פרויקט מחקר להשכלה גבוהה (NJZZ18047), האזור האוטונומי של מונגוליה הפנימית Linxue “כפול במחלקה ראשונה” פרויקט בנייה (170001).
Materials
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
References
- Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
- Liu, C. The development of the scanning electron microscopy (sem) and its application in polymer materials research. Journal of the Graduates Sun Yat-Sen University (Natural Sciences Medicine). 34, 7-12 (2008).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Quarterly Reviews of Biophysics. 45, 27-56 (2011).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. The Journal of Cell Biology. 202, 407-419 (2013).
- Trepout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (121), e55215 (2017).
- Zhang, X. J., Sun, W., Zhang, J., Zuo, T. T., Wang, Z. Q., Zhao, H. W. Research progress of coleopteran insect species antennal sensilla. Journal of Anhui Agricultural Sciences. 41, 2932-2935 (2013).
- Aldrich, J. R., Bartelt, R. J., Dickens, J. C., Knight, A. L., Light, D. M., Tumlinson, J. H. Insect chemical ecology research in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Management Science. 59, 777-787 (2003).
- Thomas, C. B., Marlin, E. R. Pheromone mating disruption: Novel, non-toxic control of the European corn borer. Leopold Center. 8, 57-60 (1999).
- Chen, X. F., Hu, M. Y. Studies on the specimen preparation techniques of scanning electron microscope of Ficus simplicissima Lour. Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 14, 68-70 (2001).
- Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy (SEM). Scanning Microscopy for Nanotechnology. , 1-40 (2006).
- Kothekar, S. C., Ware, A. M., Waghmare, J. T., Momin, S. A. Comparative Analysis of the Properties of Tween-20, Tween-60, Tween-80, Arlacel-60, and Arlacel-80. Journal of Dispersion Science and Technology. 28, 477-484 (2007).
- Chai, J. L., Liu, N., Bai, T. T., Zhang, H. M., Liu, N. N., Wang, D. D. Compositions and Physicochemical Properties of Tween Type Surfactants-Based Microemulsions. Journal of Dispersion Science and Technology. 35, 441-447 (2014).
- Zhang, L. D., Zhao, L., Han, F., Xu, B. C. Performance and applications of surfactants (XV) Detergency of surfactants and its applications. China Surfactant Detergent and Cosmetics. 45, 132-137 (2015).
- Waghmare, P. R., Das, S., Mitra, S. K. Under-water superoleophobic glass: unexplored role of the surfactant-rich solvent. Scientific Reports. 3, 1-25 (2013).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Luo, Y. Q. Microtomy of insect sensilla embedded in resin blocks for transmission electronic microscopy. Chinese Journal of Applied Entomology. 50, 1479-1483 (2013).
- Zong, S. X., Liu, X. H., Cao, C. J., Luo, Y. Q., Ren, L. L., Zhang, H. Development of semiochemical attractants for monitoring and controlling Chlorophorus caragana. Zeitschrift für Naturforschung. 68, 243-252 (2013).
- Sumner, M. J. Epoxy resins for light and transmission electron microscopy. Plant Microtechniques and Protocols. , 83-101 (2015).
- Schneider, D. Insect antennae. Annual Review of Entomology. 9, 103-122 (1964).
- Zacharuk, R. Antennae and sensilla. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 6, 1-69 (1985).
- Zacharuk, R., Albert, P., Bellamy, F. Ultrastructure and function of digitiform sensilla on the labial palp of a larval elaterid (Coleoptera). Canadian Journal of Zoology. 55, 569-578 (1977).
- Shanbhag, S., Müller, B., Steinbrecht, R. Atlas of olfactory organs of Drosophila melanogaster: 1, Types, external organization, innervation and distribution of olfactory sensilla. International Journal of Insect Morphology and Embryology. 28, 377-397 (1999).
- Tarumingkeng, R. C., Coppel, H. C., Matsumura, F. Morphology and ultrastructure of the antennal chemoreceptors and mechanoreceptors of worker Coptotermes formosanus Shiraki. Cell Tissue Res. 173, 173-178 (1976).
- Zacharuk, R. Y. Ultrastructure and function of insect chemosensilla. Annual Review of Entomology. 25, 27-47 (1980).
- Li, Y. Z., Zhong, G. Q. Screening of detergents and floating carriers for treating potato golden nematode cysts to improve the original appearance of electron microscopy. Plant quarantine. 8, 72-75 (1994).
- Marzio, L. D., Marianecci, C., Petrone, M., Rinaldi, F., Carafa, M. Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between tween 21 and tween 20. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 82, 18-24 (2011).
- Ren, L. L., Wu, Y., Shi, J., Zhang, L., Luo, Y. Q. Antenna morphology and sensilla ultrastructure of Tetrigus lewisi Candèze (Coleoptera: Elateridae). Micron. 60, 29-38 (2014).
- Ren, L., Shi, J., Zhang, Y., Luo, Y. Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides (Fairmaire) (Coleoptera: Bothrideridae). Micron. 43, 921-928 (2012).
- Teng, X. H., Liu, X. L., Xie, G. Y., Tang, Q. B., Li, W. Z., Zhao, X. C. Morphology and distribution of ovipositor sensilla of female Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae). The 11th Henan Plant Protection Society, the 10th Henan Insect Society, and the 5th Member Congress and Academic Symposium of Henan Plant Pathology Society. , 138-142 (2017).
- Yang, R., Zhang, L. N., Fan, J. W., Wang, J. L., Fang, K. F., Yu, T. Q., Wang, S. H., Du, Y. L. Insect specimens for scanning electron microscopy. Journal of Beijing University of Agriculture. 29, 33-36 (2014).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Zhang, L., Wang, R., Yu, Y., Lu, P. F., Luo, Y. Q. Ultrastructure and distribution of sensilla on the maxillary and labial palps of Chlorophorus caragana (Coleoptera: Cerambycidae). Journal of Morphology. 279, 574-588 (2018).
- Harrison, J. D. G. Cleaning and preparing adult beetles (Coleoptera) for light and scanning electron microscopy. African Entomology. 20, 395-401 (2012).
- Xiao, Y., Liu, W., Wang, Y., Zuo, Y. X., Hu, R., Li, T. T., Cui, Z. B. Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope. Research and Exploration Laboratory. 32, 46-53 (2013).
- Graef, M. D. . Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy. , 1 (2003).
