طريقة إعداد عينة من المسح الضوئي وانتقال المجهر الإلكتروني لزوائد خنفساء الخشب
Summary
من أجل مراقبة البنية الفائقة للsensilla الحشرات ، تم عرض المسح الضوئي والمجهر الإلكتروني للإرسال (SEM و TEM ، على التوالي) بروتوكول إعداد العينة في الدراسة. تمت إضافة Tween 20 إلى المثبت لتجنب تشوه العينة في SEM. كان المجهر الفلوري مفيدًا لتحسين دقة التقطيع في TEM.
Abstract
وصف هذا التقرير طرق إعداد العينة التي تقوم بمسح وانتقال ملاحظات المجهر الإلكتروني ، التي تجلت من خلال إعداد الزوائد من الخنفساء الخشبية ، Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012) ، لكلا النوعين من المجهر الإلكتروني. واستند بروتوكول إعداد عينة المجهر الإلكتروني المسح (SEM) على تثبيت عينة الكيميائية، والجفاف في سلسلة من حمامات الإيثانول، والتجفيف، وطلاء البولتر. بإضافة Tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan laurate) إلى محلول الغسيل والمثبت ، تم غسل سطح جسم الحشرات من خنفساء الخشب بشكل أكثر نظافة في SEM. هذه الدراسة المجهرية الإلكترونية انتقال (TEM) إعداد عينة شملت سلسلة من الخطوات بما في ذلك التثبيت، وجفاف الإيثانول، والتضمين في الراتنج، وتحديد المواقع باستخدام المجهر الفلوري، والقسمة، وتلطيخ. Fixative مع Tween 20 تمكين اختراق جدار جسم الحشرات من خنفساء الخشب أكثر سهولة مما كان عليه من دون Tween 20 ، وبالتالي أفضل الأنسجة الثابتة والأعضاء في الجسم ، وبالتالي أسفرت عن ملاحظات المجهر الإلكتروني انتقال واضح من الهياكل الفائقة sensilla الحشرات. وكانت الخطوة التالية من هذا الإعداد تحديد مواقف sensilla الحشرات في العينة جزءا لا يتجزأ من كتلة الراتنج باستخدام المجهر الفلوري لزيادة دقة تحديد المواقع sensilla الهدف. هذا تحسين دقة تشريح.
Introduction
المسح المجهري الإلكترون هو أداة هامة في العديد من الدراسات مورفولوجيا، أن SEM يظهر هياكل السطح1،2. نداء المجهر الإلكتروني ناقل الحركة هو أنه يمكن استخدامه لدراسة مجموعة واسعة من الهياكل البيولوجية على مقياس نانومتر، من الهندسة المعمارية للخلايا والبنية الفائقة للorganelles، إلى بنية المجمعات الجزيئية الكلية والبروتينات. TEM يظهر الهياكل الداخلية3،4،5.
Coleoptera هي أكبر مجموعة من الحشرات ، بما في ذلك حوالي 182 أسرة و 350،000 نوع. معظم الحشرات الكولوبثران ، ولا سيما الخنفساء الخشبية ، تتغذى على النباتات ، وكثير منها آفات مهمة من الغابات وأشجار الفاكهة ، مما يسبب أضرارًا مدمرة للأشجار6. في الوقت الحاضر ، والوقاية من ومكافحة السكان من الآفات على أساس نظرية الإيكولوجيا الكيميائية قد تلقت اهتماما متزايدا7. أصبحت أساليب التحكم فعالة ومنخفضة السمية وخالية من التلوث فيرومون طريقة فعالة8. دراسة مورفولوجيا sensilla وultrastructure من الحشرات هو جزء مهم من بحوث البيئة الكيميائية الحشرية. يتم استخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي وانتقال (SEM و TEM، على التوالي) لتأثير كبير لدراسة مورفولوجيا والتشريح الداخلي. ومع ذلك ، أثناء إعداد عينات الحشرات للمجهر الإلكتروني (EM) ، قد تتأثر موضوعية وأصالة موقع المراقبة9. بشكل عام ، يتطلب إعداد عينة SEM من الحشرات التنظيف ، تثبيت الأنسجة ، الجفاف ، الميتاسب ، التجفيف ، وطلاء السطاق10. نظرًا للبيئة المعقدة التي تعيش فيها الخنفساء الخشبية ، غالبًا ما يكون لسطح الجسم ملوثات مختلفة وغالبًا ما تحتوي الزوائد عليها على العديد من السينسيلا الطويلة الجميلة أو الشعيرات. على وجه الخصوص ، لا تتوفر بعض الحطابين من تربية المختبرات ، والتي تم جمعها مباشرة في الحقل ، ثم وضعها في إصلاح السوائل لضمان نضارة ثم غسلها في المختبر. إذا تم إصلاح العينة أولاثم غسلها، فمن الواضح أنه من الصعب جدا لإزالة الحطام لأن الجلوتارالدهيد يصلح بقوة إلى العينة. Tween 20 هو السطحي11،12،13،14، الذي يلعب دورا هاما في عملية الغسيل ، بما في ذلك الحد من التوتر السطحي للمياه وتحسين قابلية المياه على سطح الغسيل. في هذه الدراسة ، تمت إضافة Tween 20 إلى محلول التثبيت ومحلول تنظيف PBS لتقليل التوتر السطحي للسائل ، ومنع الأوساخ من الترسب على سطح الجسم من الخنفساء الخشبية ، مما جعل سطح الجسم أنظف في SEM.
باستخدام TEM ، يمكن تقطيع sensilla على أعضاء مختلفة من الحشرات إلى شرائح للكشف عن الهياكل الواضحة داخلها ، مما يوفر أساسًا لتحليل وظائف sensilla. عندما تكون الحشرة الخاضعة ، مثل الخنفساء الخشبية ، كبيرة ، وجدار جسمها يحتوي على درجة كبيرة من التصلب ، لذلك قد لا تشبع المثبت أنسجة الأعضاء بالكامل داخل جسم الحشرة. Tween 20 يمكن أن تعزز قدرة التشتت والتعليق من الأوساخ. في هذه الدراسة ، تمت إضافة Tween 20 إلى المثبت لتعزيز تغلغل السوائل المثبت في جدار جسم الحشرات من الخنفساء الخشبية ، وتجنب تشوه وانهيار البشرة11،12،13. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام تكنولوجيا تشريح العامة، فمن الصعب تحديد بدقة أنواع مختلفة من sensilla، ولا سيما بالنسبة لبعض sensilla الصغيرة15. استنادًا إلى إعداد عينة TEM التقليدية ، جمعت هذه الدراسة بين المجهر الفلوري وSEM لتحديد موقف سينسيلا الحشرات في الكتلة المضمنة ، وبالتالي تحسين دقة التقطيع.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة ، قدمنا مخطط إعداد عينة للمسح الضوئي والمجهر الإلكتروني لنقل هينخة مملة الخشب. باستخدام ملحق الحشرات كموضوع دراسة تمثيلي ، أظهرنا العديد من التحسينات على طرق إعداد العينة التقليدية.
يتم استحلاب الزيت السائل المنفصل عن السطح الصلب إلى قطرات صغيرة ، والتي يمك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نقدر المساعدة السخية التي قدمتها كلية بيجين المهنية للزراعة، ومعهد تطبيق الطاقة الذرية (الأكاديمية الصينية للعلوم الزراعية)، ومركز البحوث البيولوجية التابع لجامعة بيجين للغابات، والبروفيسور شان – غان تشانغ من معهد علم الحيوان، الأكاديمية الصينية للعلوم. تم دعم هذا البحث من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFD0600103)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31570643، 81774015)، البحث العلمي للغابات في الرفاه العام في الصين (201504304)، منغوليا الداخلية الجامعة الزراعية عالية المستوى خطة بدء تشغيل البحوث المواهب (203206038)، ومنطقة منغوليا الداخلية ذاتية الحكم مشروع بحوث التعليم العالي (NJZZ18047)، منطقة منغوليا الداخلية ذاتية الحكم Linxue “مزدوجة من الدرجة الأولى” مشروع البناء (170001).
Materials
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
References
- Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
- Liu, C. The development of the scanning electron microscopy (sem) and its application in polymer materials research. Journal of the Graduates Sun Yat-Sen University (Natural Sciences Medicine). 34, 7-12 (2008).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Quarterly Reviews of Biophysics. 45, 27-56 (2011).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. The Journal of Cell Biology. 202, 407-419 (2013).
- Trepout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (121), e55215 (2017).
- Zhang, X. J., Sun, W., Zhang, J., Zuo, T. T., Wang, Z. Q., Zhao, H. W. Research progress of coleopteran insect species antennal sensilla. Journal of Anhui Agricultural Sciences. 41, 2932-2935 (2013).
- Aldrich, J. R., Bartelt, R. J., Dickens, J. C., Knight, A. L., Light, D. M., Tumlinson, J. H. Insect chemical ecology research in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Management Science. 59, 777-787 (2003).
- Thomas, C. B., Marlin, E. R. Pheromone mating disruption: Novel, non-toxic control of the European corn borer. Leopold Center. 8, 57-60 (1999).
- Chen, X. F., Hu, M. Y. Studies on the specimen preparation techniques of scanning electron microscope of Ficus simplicissima Lour. Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 14, 68-70 (2001).
- Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy (SEM). Scanning Microscopy for Nanotechnology. , 1-40 (2006).
- Kothekar, S. C., Ware, A. M., Waghmare, J. T., Momin, S. A. Comparative Analysis of the Properties of Tween-20, Tween-60, Tween-80, Arlacel-60, and Arlacel-80. Journal of Dispersion Science and Technology. 28, 477-484 (2007).
- Chai, J. L., Liu, N., Bai, T. T., Zhang, H. M., Liu, N. N., Wang, D. D. Compositions and Physicochemical Properties of Tween Type Surfactants-Based Microemulsions. Journal of Dispersion Science and Technology. 35, 441-447 (2014).
- Zhang, L. D., Zhao, L., Han, F., Xu, B. C. Performance and applications of surfactants (XV) Detergency of surfactants and its applications. China Surfactant Detergent and Cosmetics. 45, 132-137 (2015).
- Waghmare, P. R., Das, S., Mitra, S. K. Under-water superoleophobic glass: unexplored role of the surfactant-rich solvent. Scientific Reports. 3, 1-25 (2013).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Luo, Y. Q. Microtomy of insect sensilla embedded in resin blocks for transmission electronic microscopy. Chinese Journal of Applied Entomology. 50, 1479-1483 (2013).
- Zong, S. X., Liu, X. H., Cao, C. J., Luo, Y. Q., Ren, L. L., Zhang, H. Development of semiochemical attractants for monitoring and controlling Chlorophorus caragana. Zeitschrift für Naturforschung. 68, 243-252 (2013).
- Sumner, M. J. Epoxy resins for light and transmission electron microscopy. Plant Microtechniques and Protocols. , 83-101 (2015).
- Schneider, D. Insect antennae. Annual Review of Entomology. 9, 103-122 (1964).
- Zacharuk, R. Antennae and sensilla. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 6, 1-69 (1985).
- Zacharuk, R., Albert, P., Bellamy, F. Ultrastructure and function of digitiform sensilla on the labial palp of a larval elaterid (Coleoptera). Canadian Journal of Zoology. 55, 569-578 (1977).
- Shanbhag, S., Müller, B., Steinbrecht, R. Atlas of olfactory organs of Drosophila melanogaster: 1, Types, external organization, innervation and distribution of olfactory sensilla. International Journal of Insect Morphology and Embryology. 28, 377-397 (1999).
- Tarumingkeng, R. C., Coppel, H. C., Matsumura, F. Morphology and ultrastructure of the antennal chemoreceptors and mechanoreceptors of worker Coptotermes formosanus Shiraki. Cell Tissue Res. 173, 173-178 (1976).
- Zacharuk, R. Y. Ultrastructure and function of insect chemosensilla. Annual Review of Entomology. 25, 27-47 (1980).
- Li, Y. Z., Zhong, G. Q. Screening of detergents and floating carriers for treating potato golden nematode cysts to improve the original appearance of electron microscopy. Plant quarantine. 8, 72-75 (1994).
- Marzio, L. D., Marianecci, C., Petrone, M., Rinaldi, F., Carafa, M. Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between tween 21 and tween 20. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 82, 18-24 (2011).
- Ren, L. L., Wu, Y., Shi, J., Zhang, L., Luo, Y. Q. Antenna morphology and sensilla ultrastructure of Tetrigus lewisi Candèze (Coleoptera: Elateridae). Micron. 60, 29-38 (2014).
- Ren, L., Shi, J., Zhang, Y., Luo, Y. Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides (Fairmaire) (Coleoptera: Bothrideridae). Micron. 43, 921-928 (2012).
- Teng, X. H., Liu, X. L., Xie, G. Y., Tang, Q. B., Li, W. Z., Zhao, X. C. Morphology and distribution of ovipositor sensilla of female Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae). The 11th Henan Plant Protection Society, the 10th Henan Insect Society, and the 5th Member Congress and Academic Symposium of Henan Plant Pathology Society. , 138-142 (2017).
- Yang, R., Zhang, L. N., Fan, J. W., Wang, J. L., Fang, K. F., Yu, T. Q., Wang, S. H., Du, Y. L. Insect specimens for scanning electron microscopy. Journal of Beijing University of Agriculture. 29, 33-36 (2014).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Zhang, L., Wang, R., Yu, Y., Lu, P. F., Luo, Y. Q. Ultrastructure and distribution of sensilla on the maxillary and labial palps of Chlorophorus caragana (Coleoptera: Cerambycidae). Journal of Morphology. 279, 574-588 (2018).
- Harrison, J. D. G. Cleaning and preparing adult beetles (Coleoptera) for light and scanning electron microscopy. African Entomology. 20, 395-401 (2012).
- Xiao, Y., Liu, W., Wang, Y., Zuo, Y. X., Hu, R., Li, T. T., Cui, Z. B. Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope. Research and Exploration Laboratory. 32, 46-53 (2013).
- Graef, M. D. . Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy. , 1 (2003).
