Summary

Visualizar el deterioro de las barreras endoteliales y Glial de la unidad Neurovascular durante la encefalomielitis Autoinmune Experimental In Vivo

Published: March 26, 2019
doi:

Summary

Aquí, presentamos los protocolos para investigar el deterioro de la unidad neurovascular durante la encefalomielitis autoinmune experimental en vivo. Específicamente abordamos cómo determinar permeabilidad de la barrera blood – brain y gelatinasa actividad involucrada en la migración de leucocitos a través de la glía INCURVATA4.

Abstract

La unidad neurovascular (NVU) se compone de células endoteliales microvasculares formando la barrera blood – brain (BBB), una membrana basal endotelial con pericitos encajado, y la glia INCURVATA4 compuesta por la membrana basal parenquimal y astrocíticos alimentación final abarca el aspecto abluminal de microvasos del sistema nervioso central (SNC). Además de mantener el CNS homeostasis el NVU controla tráfico de células inmunes en el SNC. Durante el ataque del SNC bajo número de linfocitos activados puede cruzar la barrera endotelial sin causar disfunción BBB o enfermedad clínica. En contraste, durante la neuroinflamación tales como esclerosis múltiple o su modelo animal encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) un gran número de células inmunes puede cruzar el BBB y posteriormente la glia INCURVATA4 eventualmente alcanzar el parénquima de la CNS hacia la enfermedad clínica. Migración de células inmunes en la parenquimia del CNS es así un proceso de dos etapas que implica una migración secuencial a través de la barrera endotelial y glial de NVU empleando distintos mecanismos moleculares. Si después de su paso a través de la barrera endotelial, células T encuentran su antígeno cognado en células presentadoras de antígenos perivasculares su reactivación local iniciará posterior mecanismos que conducen a la activación focal de matrilisina, que permitirá a las células T cruzar la barrera glial y entrar en el parénquima del CNS. Por lo tanto, evalúe la permeabilidad BBB y actividad MMP en correlación espacial con acumulación de células inmunitarias en el SNC durante la EAE permite para especificar la pérdida de la integridad de las barreras endoteliales y gliales del NVU. Aquí mostramos cómo inducir EAE en ratones C57BL/6 por inmunización activa y posteriormente analizar permeabilidad BBB en vivo usando una combinación de marcadores fluorescentes exógenos. Mostramos además, cómo visualizar y localizar la actividad gelatinasa en el cerebro de EAE por zymogaphy in situ junto a los stainings inmunofluorescentes de las membranas del sótano BBB y CD45 + invade las células inmunes.

Introduction

Sistema nervioso central (SNC) coordina todos los cuerpo y las funciones mentales en los vertebrados, y homeostasis del CNS es esencial para una adecuada comunicación de las neuronas. Homeostasis de la CNS está garantizada por la unidad neurovascular (NVU), que protege el SNC desde el ambiente cambiante de la corriente sanguínea. El NVU se compone de células endoteliales microvasculares de la CNS, bioquímicamente único y establecen la barrera blood – brain (BBB) en continua interferencia con pericitos, astrocitos, neuronas y componentes de la matriz extracelular (ECM), establecimiento de dos las distintas membranas del sótano1. La membrana basal endotelial que ensheathes el aspecto abluminal de las células endoteliales de BBB alberga un alto número del pericitos y se compone de laminina α4 y α5 del laminin, además de otras proteínas de ECM2. En contraste, la membrana basal parenquimal consta de laminina α1 y α2 de laminina y es abrazada por fin pies astrocíticos. La membrana basal parenquimal junto con los astrositos final-pies compone el INCURVATA4 de glia que segrega la red neuronal del CNS de la llena de líquido cerebroespinal perivascular o espacios subaracoideos3. Debido a la arquitectura única del NVU, células inmunitarias trata hacia el SNC es distinto que en los tejidos periféricos ya que requiere un proceso de dos pasos con las células inmunes, primero incumplimiento BBB endotelial y posteriormente la glia INCURVATA4 a fin de alcanzar el parénquima de la CNS.

Esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad común de la capensis del CNS, en la que un gran número de células inmunes circulantes entre el SNC y causar neuroinflamación, desmielinización y pérdida focal de BBB integridad4. Pérdida de la integridad BBB es un sello temprano de MS, como se indica por la presencia de contraste de gadolinio mejora las lesiones en el SNC como visualizado por la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI)5. Extravasación del leucocito en el SNC se produce a nivel de vénulas postcapilares; sin embargo, los mecanismos precisos involucrados en la diapedesis celular inmune a través de la membrana del sótano BBB y posteriormente la barrera glial quedan por explorarse. Encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) sirve como un modelo animal para MS y ha contribuido significativamente a nuestro conocimiento actual sobre la patogenia de la EM. Por ejemplo, utilizando el modelo EAE se ha descubierto que la extravasación del leucocito ocurre en un proceso de varios pasos, incluyendo una captura inicial y balanceo paso mediado por selectinas y moléculas de mucina-como como ligando glicoproteína P-selectina (PSGL) -1, seguido por detención firme dependiente de integrinas y arrastre de células T en las células endoteliales de BBB a lados permisivas por diapedesis6.

Una vez que las células T han cruzado el BBB endotelial y la membrana basal endotelial, que necesitan encontrar su antígeno cognado en macrófagos o células dendríticas localizadas estratégicamente en los espacios de leptomeningeal o perivascular. Esta interacción induce producción focal de mediadores pro-inflamatorios disparo los mecanismos posteriores necesarios para la invasión del tejido del CNS de células inmunes por la glia INCURVATA47,8,9. Focal activación de metaloproteinasas de matriz (MMP) -2 y MMP-9 altera la activación de chemokine e induce la degradación de receptores de matriz extracelular en astrositos final-pies, que es un prerrequisito para inmune migración de la célula a través de la INCURVATA4 de glia en la Parénquima de CNS e inducir la aparición de síntomas clínicos de EAE10,11.

Combina la detección de CNS infiltración celular inmune con BBB actividad salida y gelatinasa en las secciones de tejido de CNS ofrece información valiosa sobre la integridad funcional de la barrera endotelial y glial en el contexto de la neuroinflamación. Por ejemplo, hemos investigado recientemente la pérdida constitutiva de la molécula de adherencia junctional de molécula endotelial ensambladura apretada (JAM)-B en el tráfico de células inmunes en el SNC en el contexto de la EAE. No comparado con saludables ratones C57BL/6 de tipo salvaje, sanas hermanos de camada de mermelada-B-deficiente mostraron ningún deterioro de la integridad BBB como se muestra en la evaluación de la permeabilidad in vivo utilizando marcadores endógenos como exógenos12. En el marco de la EAE, ratones C57BL/6 B-mermelada-deficiente mostraron síntomas de la enfermedad mejoró, que se asoció con captura de células inflamatorias en los espacios de leptomeningeal y perivascular12. Para examinar este fenómeno aplicamos zymography en situ , que permita la identificación de la actividad gelatinasa para probar si la falta de actividad gelatinasa en ratones deficientes en B-atasco puede ser responsable por el reducido número de células inmunes capaces de romper la glia INCURVATA412.

Dada la disponibilidad de diferentes genéticamente ratón modelos carece de, por ejemplo, diferentes moléculas de ensambladura apretada BBB que pueden provocar cambios en la función BBB, metodologías para investigar la integridad BBB son importantes. Además, fármacos recientemente desarrollados podrían impactar sobre las barreras NVU. Aquí mostramos cómo inducir EAE en ratones C57BL/6 por inmunización activa con la glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG)-péptido aa35-55 en adyuvantes de Freund completo. A continuación explicamos cómo localizar la infiltración de células inmunitarias a través de las barreras endoteliales y gliales del NVU y cómo estudiar la integridad de la barrera endotelial y glial en vivo por la detección in situ de marcadores exógenos y la actividad gelatinasa, respectivamente.

Protocol

Todos los estudios se llevaron a cabo bajo las directrices de acuerdo con la legislación Suiza relativa a la protección de los animales y fueron aprobados por la Oficina veterinaria del cantón de Berna, Suiza (número de autorización: BE 31/17 y ser 77/18). 1. vivienda de ratones C57BL/6 en la condiciones libres de patógenos específicos (SPF) Ciclo de ratones en jaulas individuales ventilados con una 12/12 h luz / oscuridad de la casa. Proporcionar alimento y agua ad libidum. …

Representative Results

Evaluación del curso clínico de la EAE en ratones C57BL/6 debe resultar en una curva de la enfermedad como se muestra en la figura 2A y los cambios en el peso corporal de ratón tal como se presenta en la figura 2B. Ratones C57BL/6 inmunizados con MOGaa35-55 generalmente comienzan a desarrollar síntomas de la enfermedad alrededor de 10-12 días después de la inmunización activa (figura 1A). Por lo general, ratones vacunados mue…

Discussion

Aquí, presentamos un protocolo para inducir y controlar EAE en ratones C57BL/6 femeninos. Preferentemente se eligen las hembras, y hay una incidencia de las mujeres: los hombres de 3:1 en MS. Para evaluar la severidad de la EAE, hicimos uso de una hoja de puntuación de 3 puntos. Severidad de la EAE se anotó generalmente con respecto a la gravedad de los trastornos motores. Ratones con avanzadas fases de la EAE, es decir, exhibiendo una puntuación por encima de 2 debería ser sacrificado para evitar sufrimiento innece…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Sorokin de Lydia, que compartió con nosotros su original en situ zymography de protocolo10 .

Materials

AMCA anti-rabbit antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-045 Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11) Pharmingen 07-1401 Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody DAKO Z0097 Store at 4 °C
Breeding food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III e.g. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction V Applichem A1391 Store at 4 °C
Cold gelatine Sigma-Aldrich G 9391
Coplin jar + rack e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-144 Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1 e.g. Thermo Scientific 85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) e.g. Molecular probes D22910 Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW) Invitrogen D3328 Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit  Thermo Fisher Scientific; EnzCheck E12055 Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) e.g. Janvier Labs Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Santa Cruz Biotechnology sc-24648 Store at 4°C
Maintenance food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3436
MOGaa35-55 peptide e.g. GenScript Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus ) Thermo Scientific J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA e.g. BD 231141 Store at 4 °C 
NaCl 0.9 % B. Braun 3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) Sakura 4583
Omnican 50 30G x ½’’ B. Braun 9151125S
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4
Pertussis toxin e.g. List biological laboratories, Inc. 180 Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) Sigma-Aldrich 81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) Sigma-Aldrich 4693132001 Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen e.g. DAKO S2002
sealing film e.g. Parafilm M e.g Sigma-Aldrich P7793
Silica gel e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 9351.1
Stitch scissor F.S.T 15012-12
syringe 1 ml e.g. PRIMO 62.1002
syringe 10 ml e.g. CODAN Medical ApS 2022-05
vaporizer system Univentor 400 UNO.BV

References

  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis–a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

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Cite This Article
Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).

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