Summary

Zwemmen geïnduceerde verlamming te beoordelen Dopamine signalering in Caenorhabditis elegans

Published: April 03, 2019
doi:

Summary

Zwemmen geïnduceerde verlamming (SWIP) is een gevestigde gedrags test gebruikt bij het bestuderen van de onderliggende mechanismen van dopamine signalering in Caenorhabditis elegans (C. elegans). Een gedetailleerde methode voor het uitvoeren van de bepaling ontbreekt echter. Hier beschrijven we een stapsgewijze protocol voor SWIP.

Abstract

De bepaling van de zwemmen beschreven in dit protocol is een geldig instrument om te identificeren eiwitten reguleren van de Dopaminerge synapses. Net als bij zoogdieren, dopamine (DA) bepaalt verscheidene functies in C. elegans met inbegrip van leren en motorische activiteit. Voorwaarden die stimuleren DA vrijkomen (bijvoorbeeld amfetamine (AMPH) behandelingen) of die voorkomen DA klaring (bijvoorbeeld dieren ontbreekt de DA vervoerder (dat-1) die zijn niet in staat van DA reaccumulating in de neuronen) genereren van een overmaat van extracellulaire DA wat uiteindelijk resulteert in geremde motoriek. Dit probleem is vooral duidelijk wanneer dieren in water zwemmen. In feite, terwijl de wild-type dieren blijven om te zwemmen voor een langere periode, dat-1 null mutanten en wild-type behandeld met AMPH of remmers van de DA vervoerder zinken naar de bodem van de put en niet verplaatst. Dit gedrag heet “Zwemmen geïnduceerde verlamming” (SWIP). Hoewel de bepaling SWIP goed ingeburgerd is, ontbreekt een gedetailleerde beschrijving van de methode. Hier beschrijven we een stapsgewijze handleiding voor het uitvoeren van SWIP. Voor het uitvoeren van de bepaling, worden laat larvale stadium-4 dieren geplaatst in een plek glasplaat met sacharose bedieningsoplossing met of zonder AMPH. Dieren worden gescoord voor hun zwemmen gedrag of handmatig door visualisatie onder een stereoscoop automatisch door opname met een camera gemonteerd op de stereoscoop. Video’s worden vervolgens geanalyseerd met behulp van een tracking-software, die een visuele weergave van pak slaag frequentie en verlamming in de vorm van warmte kaarten levert. Zowel de handmatige en geautomatiseerde systemen garanderen een gemakkelijk meetbare uitlezing van de dieren zwemmen vermogen en aldus vergemakkelijken screening voor vaneenkeurmerkzijnvoorzien mutaties binnen het Dopaminerge systeem of voor ondersteunende genen. Daarnaast kan de SWIP ophelderen van het werkingsmechanisme van drugs misbruik zoals AMPH worden gebruikt.

Introduction

Dieren te vervullen, een verscheidenheid van aangeboren en complexe problemen die worden bemiddeld door verschillende neurotransmitters gecoördineerd door ingewikkelde signalering processen. De neurotransmitter dopamine (DA) bemiddelt zeer geconserveerde gedrag over soorten, waaronder learning, motor functie en verwerking van beloning.

De bodem nematode C. elegans, met een relatief eenvoudige en goed toegewezen zenuwstelsel bestaande uit alleen 302 neuronen, toont duidelijk complexe gedrag, waaronder vele die zijn geregeld bij DA zoals paring, leren, foerageren, motoriek en leggen van eieren 1. Markeer onder andere functies, korte levenscyclus, gebruiksgemak en de instandhouding van de signalering van moleculen, de voordelen van het gebruik van C. elegans als een model voor het bestuderen van de neurale basis van geconserveerde gedrag.

De hermafrodiet C. elegans bevat acht Dopaminerge neuronen; Naast deze bevat de man zes extra paren voor paring doeleinden. Zoals bij zoogdieren, deze neuronen DA synthetiseren en express de DA transporter (DAT-1), een membraan eiwit gevonden uitsluitend in Dopaminerge neuronen, waarvan transports DA vrijkomen in de synaptische gespleten terug de Dopaminerge neuronen. Bovendien, de meeste van de eiwitten die betrokken zijn bij elke stap van synthese, de verpakking en de release van DA zijn zeer bewaard tussen wormen en mens en zoals bij zoogdieren, DA moduleert voeding gedrag en motoriek in C. elegans2.

C. elegans doorzoekt op vaste oppervlakken en zwemt met een karakteristieke pak slaag gedrag in water. Interessant, mutanten expressie voor DAT-1 (dat-1) ontbreekt normaal kruipen op harde ondergrond maar niet zwemmen wanneer ondergedompeld in water te houden. Dit probleem was zwemmen geïnduceerde verlamming of SWIP genoemd. Eerdere experimenten aangetoond dat SWIP, gedeeltelijk wordt veroorzaakt door een overmaat aan DA in de synaptische spleet die uiteindelijk overstimulates de D2-achtige postsynaptisch receptoren (DOP-3). Hoewel oorspronkelijk geïdentificeerd in dat-1 knockout dieren3, SWIP is ook waargenomen in het wild-type dieren behandeld met medicijnen die de activiteit blok DAT (bijvoorbeeld imipramine4) en/of induceren DA release (bijvoorbeeld amfetamine5). Aan de andere kant, voorkomen farmacologische of genetische manipulaties afwenden van synthese en release van DA en het blokkeren van DOP-3 receptor functie SWIP6. Samen hebben deze reeds gepubliceerde gegevens SWIP opgericht als een betrouwbaar hulpmiddel te bestuderen van de gedragsmatige gevolgen veroorzaakt door gemuteerde eiwitten binnen Dopaminerge synapsen3,4,7 en kunnen worden ingezet voor voorwaartse genetische schermen voor de identificatie van nieuwe regelgevende trajecten die betrokken zijn bij DA signalering7,8,9,10,11,12. Bovendien, door het verstrekken van een gemakkelijk meetbare uitlezing van drug-geïnduceerde gedrag in levende dieren, SWIP maakt het ontrafelen van de mechanismen van de actie van drugs zoals amfetamine (AMPH) en azaperone op de Dopaminerge synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.

Protocollen voor het uitvoeren van de tests SWIP zijn vóór16beschreven. Hier beschrijven we in detail de methodologie en de setup voor het uitvoeren van de test met het doel van het verstrekken van een visuele gids voor de C. elegans -Gemeenschap voor het effectief uitvoeren van SWIP.

Protocol

1. bereiding van de oplossingen en Media M9 buffer door ontbinding KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6.0 g (42.2 mM), bereiden en NaCl 5.0 g (85,5 mM) in 1 L gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water. Voeg 1,0 mL 1 M MgSO4 (12 g in een eindvolume van 100 mL gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water) na autoclaaf. Mix 100 mL van de resulterende 10 x M9 met gesteriliseerde met autoclaaf 900 mL gedeïoniseerd water zodat een oplossing 1 x.</li…

Representative Results

Presenteren we een voorbeeld van SWIP assay geïnduceerd door AMPH behandeling. Figuur 1 toont een schematische voorstelling van de test setup zoals hierboven beschreven. Voor de handmatige assay, ongeveer 8-10 leeftijd gesynchroniseerde laat L4 fase wormen verzameld met een wimper of platina worden halen en geplaatst in een plek glasplaat gevuld met 40 µL van 200 mOsm/L sacharose (bedieningsoplossing) of sacharose met 0,5 mM AMPH en getest voor SWIP. <p…

Discussion

Hier beschrijven we een stapsgewijze protocol voor het uitvoeren van een gedrags assay, SWIP, in C. elegans. Dit protocol is eenvoudig en ongecompliceerd met geen grote technische hindernissen maken van deze test zeer gebruiker vriendelijk. Er zijn echter enkele kritieke aspecten die worden genomen moeten om het effectief uitvoeren van de bepaling.

Zorg moet worden genomen om ervoor te zorgen dat de wormen gebruikt voor de assay goed gevoed, aangezien dieet beperking SWIP<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedank Dr. Osama Refai van Dr. Randy Blakely van lab voor begeleiding met de geautomatiseerde analyse van SWIP. Dit werk werd gesteund door de financiering van NIH R01 DA042156 LC.

Materials

Aluminum foil Reynolds wrap 1091835
Amphetamine Sigma 51-63-8  
Autoclave
Bacterial Incubator New Brunswick scientific M1352-0000
Bacteriological grade, Agar Lab Scientific, Inc  A466
Bacto (TM) Peptone BD REF 211677
Calcium Chloride (dihydrate) Sigma-Aldrich C3881
Camera  Thorlabs U-CMAD3
Centrifuge  Eppendorf 5810R 15amp E215059
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5
Deionised water Millipore Z00QSV0WW Milli-Q
Depression glass spot plate Corning Corning, Inc. 722085
Erlenmeyer flask ThermoFisher 4103-0250PK
Eye lash
Glass slide Fisherbrand 12-550-15
Graphing and statistical software Prism Graphpad 5
HEPES Sigma-Aldrich RB=H3375 & H7006
Hypochlorite Hawkins Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal
LB Broth, Miller Fisher BP1426
Magnesium Chloride (Hexahydrate) Sigma-Aldrich RB=M0250 500g
Magnesium sulfate (heptahydrate) Sigma-Aldrich M1880
Magnetic stir bar Fisherbrand 16-800-510 
Microcentrifuge tubes ThermoFisher 69715
NA 22 bacteria CGC
Nystatin Sigma 1400-61-9
Osmometer Advanced Instruments, Inc Model 3320
Pasteur Pipettes Fisherbrand 13-678-20A
Petriplates Falcon 351007
pH Meter Orion VersaStar Pro IS-68X591202-B 0514
Polystrine conical tubes Falcon 352095
Potassium Chloride Sigma-Aldrich  P9541
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich 7778-77-0
Potassium Phosphate – DIBASIC Sigma-Aldrich P-8281
Potassium Phosphate – MONOBASIC Sigma-Aldrich P0662
Serological pipettes VWR 10ml=89130-898
Shaker Reliable Scientific 55S 12×16
Sodium Chloride Fisher RB=BP358-1
Sodium dihydrogen Phosphate Fisher RB=S381
Spreadsheet MS office Microsoft Excel
Stereo Microscope Zeiss Model tlb3. 1 stemi2000
Sterile Pipette tips Various 02-707-400
Sucrose Sigma-Aldrich RB=S5016
Superglue Loctite 1647358 .14 oz.
SwimR sofware 10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2 Worm Tracker 2.0 www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software Virtualdub http://www.virtualdub.org/

References

  1. de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
  2. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  3. McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
  4. Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
  5. Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
  6. Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
  7. Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
  8. Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
  9. Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), 961-975 (2012).
  10. Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
  11. Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).
  12. Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
  13. Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
  14. Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
  15. Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
  16. Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
  17. Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).
  18. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  19. Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
  20. Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
  21. Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).

Play Video

Cite This Article
Kudumala, S., Sossi, S., Carvelli, L. Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (146), e59243, doi:10.3791/59243 (2019).

View Video