A gravação da único-fibra é uma técnica eletrofisiológicos eficaz que seja aplicável aos sistemas nervosos centrais e periféricos. Junto com a preparação de DRG intact com o nervo ciático Unido, o mecanismo da falha da condução é examinado. Ambos os protocolos melhoram a compreensão da relação do sistema nervoso periférico com a dor.
A gravação da único-fibra foi uma técnica eletrofisiológicos clássica e eficaz sobre as últimas décadas por causa de sua aplicação específica para fibras de nervo nos sistemas nervosos centrais e periféricos. Este método é particularmente aplicável aos gânglios da raiz dorsal (DRG), que são neurônios sensoriais primários que exibem uma estrutura pseudounipolar de processos nervosos. Os padrões e características dos potenciais de ação passados ao longo de axônios são graváveis nesses neurônios. O presente estudo utiliza gravações in vivo de fibra única para observar a falha de condução dos nervos ciáticos em ratos tratados com adjuvante completo de Freund (CFA). Porque o mecanismo subjacente não pode ser estudado usando gravações in vivo da único-fibra, remendo-grampo-gravações de neurônios de DRG são executados em preparações de DRG intact com o nervo ciático Unido. Estas gravações revelam uma correlação positiva entre a falha da condução e a inclinação de aumentação do potencial After-hyperpolarization (AHP) de neurônios de DRG em animais CFA-tratados. O protocolo para gravações in vivo de fibra única permite a classificação das fibras nervosas através da mensuração da velocidade de condução e monitorização das condições anormais nas fibras nervosas em determinadas doenças. DRG intact com nervo periférico Unido permite a observação da atividade de neurônios de DRG em a maioria de circunstâncias physiological. Conclusivamente, a gravação de fibra única combinada com a gravação eletrofisiológica de DRGs intactos é um método eficaz para examinar o papel da falha de condução durante o processo analgésico.
A transmissão normal da informação ao longo das fibras nervosas garante a função normal do sistema nervoso. O funcionamento anormal do sistema nervoso também é refletido na transmissão do sinal elétrico de fibras nervosas. Por exemplo, o grau de desmielinização nas lesões de desmielinização central pode ser classificado através da comparação das alterações na velocidade de condução nervosa antes e após a aplicação da intervenção1. É difícil de registrar as fibras nervosas intracellularmente, exceto em preparações especiais, como o AXON gigante de Lula2. Portanto, a atividade eletrofisiológica só é gravável através do registro extracelular de fibras únicas. Como um dos métodos electrofisiológicos clássicos, a gravação da único-fibra tem uma história mais longa do que outras técnicas. No entanto, menos eletrofisiologistas agarrando este método apesar de sua extensa aplicação. Portanto, uma introdução detalhada do protocolo padrão para gravação de fibra única é necessária para sua aplicação apropriada.
Embora as várias técnicas da remendo-braçadeira dominem o estudo eletrofisiológicos moderno, a gravação da único-fibra ainda joga um papel insubstituível em registrar as atividades de fibras de nervo, especial fibras que transmitem a sensação periférica com seus corpo de células sensoriais localizado no gânglio da raiz dorsal (DRG). A vantagem de usar a gravação da único-fibra aqui é que a gravação in vivo da fibra fornece um tempo longo da observação com a capacidade para gravar respostas aos estímulos naturais em modelos pré-clínicos sem violação do ambiente intracelular3 , a 4.
Um número crescente de estudos nas duas últimas décadas examinou funções complexas ao longo das fibras nervosas5, e a falha de condução, que é definida como um estado de transmissão de impulso do nervo mal sucedido ao longo do axão, estava presente em muitos diferentes nervos periféricos6,7. A presença de falha de condução em nossa investigação serviu como mecanismo intrínseco de autoinibição para a modulação da entrada nociceptiva persistente ao longo das fibras C8. Esta falha da condução foi atenuada significativamente condições de hiperalgesia4,9. Portanto, direcionar os fatores envolvidos na falha de condução pode representar um novo tratamento para a dor neuropática. Para observar a falha de condução, o padrão de queima deve ser gravado e analisado com base em picos sequencialmente descarregados com base na gravação de fibra única.
Para compreender completamente o mecanismo da falha da condução, é necessário identificar as propriedades da transmissão do axônio, ou mais precisamente, as propriedades da membrana de neurônios de DRG, baseadas em suas propriedades anatômicas pseudounipolares. Muitos estudos prévios neste campo foram realizados em neurônios dissociados de DRG10,11, oque pode não ser viável para a investigação da falha de condução devido a dois obstáculos. Em primeiro lugar, vários métodos mecânicos e químicos são usados no processo de dissociação para libertar neurônios DRG, o que pode resultar em células não saudáveis ou alterar o fenótipo/propriedades dos neurônios e confundir os achados. Em segundo, os nervos periféricos anexados são removidos basicamente, e os fenômenos da falha da condução não são observáveis nestas preparações. Conseqüentemente, uma preparação de neurônios intactos de DRG com um nervo Unido foi melhorada para evitar os obstáculos acima mencionados.
Embora os estudos recentes alcangaram a imagem latente do cálcio de neurônios de DRG in vivo16, realizando a gravação in vivo da remendo-braçadeira dos nociceptores individuais de DRG permanecem extremamente desafiantes. Conseqüentemente, uma aproximação in vivo da único-fibra para o campo da dor é da importância de continuação. A gravação da único-fibra no protocolo atual permite a observação objetiva de fenômenos da falha da condução, e a combinação desta técnica com a pr…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31671089 e 81470060) e Shaanxi Provincial de desenvolvimento social ciência e tecnologia projeto de pesquisa (2016SF-250).
Instruments and software used in single fiber recording | |||
Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
experiment | |||
Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
Instruments and software used in patch clamp recording | |||
Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
Other instruments | |||
Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
Solutions/perfusion/chemicals | |||
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |