Uso della registrazione in fibra singola in vivo e della radice dorsale intatta Ganglion con il nervo Sciatico attaccato per esaminare il meccanismo del fallimento della conduzione
Summary
La registrazione a fibra singola è una tecnica elettrofisiologica efficace applicabile al sistema nervoso centrale e periferico. Insieme alla preparazione della DRG intatta con il nervo sciatico attaccato, viene esaminato il meccanismo di guasto della conduzione. Entrambi i protocolli migliorano la comprensione del rapporto del sistema nervoso periferico con il dolore.
Abstract
La registrazione a fibra singola è stata una tecnica elettrofisiologica classica ed efficace negli ultimi decenni a causa della sua applicazione specifica per le fibre nervose nei sistemi nervosi centrali e periferici. Questo metodo è particolarmente applicabile ai gangli della radice dorsale (DRG), che sono neuroni sensoriali primari che presentano una struttura pseudo-unipolare dei processi nervosi. I modelli e le caratteristiche dei potenziali di azione passati lungo gli assoni sono registrati in questi neuroni. Il presente studio utilizza registrazioni in singola fibra in vivo per osservare il fallimento della conduzione dei nervi sciatici nei ratti trattati con adiuvazione di Freund (CFA) completati. Poiché il meccanismo sottostante non può essere studiato utilizzando registrazioni in vivo a singola fibra, le registrazioni patch-clamp dei neuroni DRG vengono eseguite sui preparati di DRG intatto con il nervo sciatico collegato. Queste registrazioni rivelano una correlazione positiva tra l’insufficienza di conduzione e la pendenza crescente del potenziale post-iperpolarizzazione (AHP) dei neuroni DRG negli animali trattati con CFA. Il protocollo per le singole fibre grafiche in vivo consente la classificazione delle fibre nervose attraverso la misurazione della velocità di conduzione e il monitoraggio di condizioni anomale nelle fibre nervose in determinate malattie. La DRG intatta con nervo periferico attaccato consente l’osservazione dell’attività dei neuroni DRG nella maggior parte delle condizioni fisiologiche. La registrazione a fibra singola in modo conclusivo combinato con la registrazione elettrofisiologica dei DRG intatti è un metodo efficace per esaminare il ruolo del fallimento della conduzione durante il processo analgesico.
Introduction
La normale trasmissione di informazioni lungo le fibre nervose garantisce la normale funzione del sistema nervoso. Il funzionamento anomalo del sistema nervoso si riflette anche nella trasmissione del segnale elettrico delle fibre nervose. Ad esempio, il grado di demielinazione nelle lesioni di demielinazione centrale può essere classificato mediante il confronto dei cambiamenti nella velocità di conduzione nervosa prima e dopo l’intervento applicazione1. È difficile registrare intracellulare le fibre nervose, tranne che in preparazioni speciali come l’assone gigante dei calamari2. Pertanto, l’attività elettrofisiologica è registrabile solo tramite la registrazione extracellulare di singole fibre. Come uno dei metodi elettrofisiologici classici, la registrazione a fibra singola ha una storia più lunga rispetto ad altre tecniche. Tuttavia, meno elettrofisiologi che afferrano questo metodo nonostante la sua ampia applicazione. Pertanto, per la sua applicazione appropriata è necessaria un’introduzione dettagliata del protocollo standard per la registrazione a fibra singola.
Anche se varie tecniche patch-clamp hanno dominato lo studio elettrofisiologico moderno, la registrazione a fibra singola svolge ancora un ruolo insostituibile nella registrazione delle attività delle fibre nervose, in particolare le fibre che trasmettono sensazioni periferiche con la loro corpo cellulare sensoriale situato nel ganglione della radice dorsale (DRG). Il vantaggio di utilizzare la registrazione a fibra singola qui è che la registrazione in fibra in vivo fornisce un lungo tempo di osservazione con la capacità di registrare le risposte agli stimoli naturali in modelli preclinici senza disturbo dell’ambiente intracellulare3 , 4.
Un numero crescente di studi negli ultimi due decenni ha esaminato funzioni complesse lungo le fibre nervose5, e il fallimento di conduzione, che è definito come uno stato di trasmissione dell’impulso nervoso infruttuoso lungo l’assone, era presente in molti diversi nervi periferici6,7. La presenza di fallimento di conduzione nella nostra indagine è servita come un meccanismo intrinseco autoinibitorio per la modulazione dell’input nocicettivo persistente lungo le fibre C8. Questo fallimento di conduzione è stato significativamente attenuato in condizioni di iperalgesia4,9. Pertanto, il targeting dei fattori coinvolti nell’insufficienza di conduzione può rappresentare un nuovo trattamento per il dolore neuropatico. Per osservare il fallimento della conduzione, il modello di cottura deve essere registrato e analizzato sulla base di picchi scaricati in sequenza in base alla registrazione a fibra singola.
Per comprendere a fondo il meccanismo di fallimento della conduzione, è necessario identificare le proprietà di trasmissione dell’assone, o più precisamente, le proprietà della membrana dei neuroni DRG, in base alle loro proprietà anatomiche pseudo-unipolari. Molti studi precedenti in questo campo sono stati eseguiti su neuroni DRG dissociati10,11, che potrebbero non essere fattibili per lo studio del fallimento della conduzione a causa di due ostacoli. In primo luogo, vari metodi meccanici e chimici vengono utilizzati nel processo di dissociazione per liberare i neuroni DRG, che può provocare cellule malsane o alterare il fenotipo / proprietà dei neuroni e confondere i risultati. In secondo luogo, i nervi periferici attaccati sono fondamentalmente rimossi, e i fenomeni di guasto di conduzione non sono osservabili in questi preparati. Pertanto, una preparazione di neuroni DRG intatti con un nervo attaccato è stato migliorato per evitare gli ostacoli di cui sopra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se studi recenti hanno ottenuto l’imaging del calcio dei neuroni DRG in vivo16, l’esecuzione della registrazione in vivo di morsetti da singoli nocicettori DRG rimane estremamente impegnativa. Pertanto, un approccio in vivo a fibra singola per il campo del dolore è di continua importanza. La registrazione a fibra singola nel presente protocollo consente l’osservazione oggettiva dei fenomeni di guasto della conduzione, e la combinazione di questa tecnica con la preparazione ex vivo sviluppat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della National Natural Science Foundation of China (31671089 e 81470060) e del Shaanxi Provincial Social Development Science and Technology Research Project (2016SF-250).
Materials
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
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