השימוש ב Vivo הקלטה חד-סיבים ושורש השורש שלמות עם העצב מוצמד לבחון את המנגנון של כשל הולכה
Summary
הקלטה של סיב יחיד היא טכניקת אלקטרופיסיולוגית יעילה הישימה במערכות העצבים המרכזיות וההיקפית. יחד עם הכנת DRG שלם עם העצב המכניסטי, מנגנון כשל ההולכה נבדק. שני הפרוטוקולים משפרים את ההבנה של היחסים בין מערכת העצבים ההיקפית לכאב.
Abstract
הקלטה חד-סיבי הייתה טכניקת אלקטרופיזיולוגיה קלאסית ואפקטיבית בעשורים האחרונים בגלל היישום הספציפי שלה לסיבי עצב במערכות העצבים המרכזיות וההיקפית. שיטה זו ישימה במיוחד על השורש הבסיסי (DRG), אשר הם נוירונים החושי העיקריים המוצגים מבנה מדומה חד קוטבי של תהליכים העצבים. הדפוסים והתכונות של הפוטנציאל הפעולה המועברים לאורך אקסונים לצריבה אלה נוירונים. המחקר הנוכחי משתמש הקלטות vivo סיב יחיד כדי לבחון את כישלון ההולכה של עצבי מסיבי בתוך השלם של פרוינד מטופלים (פרנק) התייחסו חולדות. כמו המנגנון הבסיסי לא ניתן לחקור באמצעות vivo יחיד סיבים הקלטות, תיקון-קלאמפ-הקלטות של הנוירונים DRG מבוצעים על ההכנות של DRG שלם עם העצב האחורי המצורפת. הקלטות אלה מגלות קורלציה חיובית בין כישלון ההולכה לבין השיפוע העולה של הפוטנציאל לאחר היפרפולריזציה (AHP) של הנוירונים בעלי חיים מטופלים. הפרוטוקול עבור vivo הקלטות סיבים יחיד מאפשר סיווג של סיבי עצב באמצעות מדידת מהירות ההולכה וניטור של מצבים חריגים סיבי העצב במחלות מסוימות. DRG שלמים עם העצב ההיקפי המצורפת מאפשר התבוננות של הפעילות של הנוירונים בסוכרת DRG ברוב התנאים הפיזיולוגיים. באופן סופי, הקלטה של סיב יחיד בשילוב עם הקלטה אלקטרולוגית של DRGs שלמים היא שיטה יעילה לבחון את התפקיד של כשל הולכה במהלך תהליך ההרגעה.
Introduction
התמסורת הנורמלית של המידע לאורך סיבי העצב מבטיחה את התפקוד התקין של מערכת העצבים. תפקוד לא תקין של מערכת העצבים משתקף גם בשידור האות החשמלי של סיבי עצב. לדוגמה, מידת הדמימידינציה בנגעים המיאלואידית המרכזית יכולה להיות מסווגת באמצעות השוואה בין שינויים במהירות הולכה עצבית לפני ואחרי יישום התערבות1. קשה לintracellularly להקליט סיבי עצב, למעט בהכנות מיוחדות כגון אקב הענק הדיונון2. לכן, פעילות אלקטרופיזיולוגית ניתנת להקלטה רק באמצעות הקלטה של סיבים בודדים. בתור אחת השיטות האלקטפיזיולוגיות הקלאסיות, הקלטה של סיבים בודדים יש היסטוריה ארוכה יותר מאשר טכניקות אחרות. עם זאת, פחות פיזיקולוגים האוחזים בשיטה זו למרות היישום הנרחב שלה. לפיכך, נדרשת הקדמה מפורטת של הפרוטוקול הסטנדרטי עבור הקלטה של סיבים בודדים עבור היישום המתאים לו.
למרות טכניקות שונות מלחציים טלאי שלטו מחקר אלקטרולוגי מודרני, הקלטה בודדת סיבים עדיין משחק תפקיד חסר תחליף בהקלטת הפעילויות של סיבי עצב, בעיקר סיבים המשדר תחושה היקפית עם תא חושי הגוף ממוקם גנגליון שורש השורש (DRG). היתרון של שימוש בהקלטה סיב יחיד כאן הוא כי בהקלטה vivo סיבים מספק זמן התבוננות ארוכה עם היכולת להקליט תגובות גירויים טבעיים במודלים פרה-קליניים ללא הפרעה של הסביבה תאיים3 , ד.
מספר גדל והולך של מחקרים בשני העשורים האחרונים בדק פונקציות מורכבות לאורך סיבי עצב5, וכישלון הולכה, אשר מוגדר כמצב של שידור הדחף עצבים שנכשלו לאורך האקסון, היה קיים ברבים שונים עצבי היקפי6,7. הנוכחות של כישלון ההולכה בחקירה שלנו שימש מנגנון מעכבות עצמי מהותי עבור אפנון של קלט nociceptive מתמשך לאורך C-סיבים8. כישלון ההולכה הזה נחלש באופן משמעותי בתנאים של היפראלגברית4,9. לכן, מיקוד הגורמים המעורבים בכישלון ההולכה עשוי לייצג טיפול חדש כאבים נוירופתיים. כדי להתבונן בכישלון ההולכה, דפוס הירי צריך להיות מוקלט ומנותח על בסיס קוצים משוחררים רציפים המבוססים על הקלטה של סיבים בודדים.
כדי להבין ביסודיות את המנגנון של כשל הולכה, יש צורך לזהות את מאפייני השידור של axon, או יותר בדיוק, את תכונות הממברנה של הנוירונים מבוססי DRG, מבוסס על מאפיינים אנטומיים מדומים שלהם-קוטבי. מחקרים קודמים רבים בתחום זה בוצעו על מכשול הנוירונים10,11, אשר עשוי לא להיות ריאלי לחקירת כשל הולכה בשל שני מכשולים. ראשית, שיטות מכני וכימי שונים משמשים בתהליך הדיסוציאציה כדי לשחרר נוירונים DRG, אשר עשוי לגרום לתאים בריאים או לשנות את פנוטיפ/תכונות של הנוירונים ולבלבל את הממצאים. שנית, העצבים ההיקפיים המצורפים יוסרו בעיקרון, ותופעות כישלון ההולכה אינן מסוימות בהכנות אלה. לכן, הכנת נוירונים DRG שלמים עם עצב מוצמד שופרה כדי למנוע את המכשולים הנ ל.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות המחקרים האחרונים השיגו סידן הדמיה של הנוירונים DRG ב vivo16, ביצוע vivo patch-קלאמפ הקלטה מ-drg בודדים הקלטת נשאר מאתגרת מאוד. לכן, גישה vivo סיב יחיד לשדה הכאב היא בעלת חשיבות מתמשכת. הקלטה של סיבים בודדים בפרוטוקול הנוכחי מאפשרת התבוננות אובייקטיבית של תופעת כישלון ההולכה, ואת השיל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מימון של הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31671089 ו 81470060) ו מחוזי שאאנקסי לפיתוח חברתי מדעי וטכנולוגיה פרויקט מחקר (2016SF-250).
Materials
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
