Verwendung von In Vivo Single-Faser-Aufnahme und intakten DorsalWurzel Ganglion mit angeschlossenem Ischiasnerv, um den Mechanismus des Leitungsversagens zu untersuchen
Summary
Die Singlefaseraufzeichnung ist eine effektive elektrophysiologische Technik, die auf das zentrale und periphere Nervensystem anwendbar ist. Zusammen mit der Vorbereitung der intakten DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv wird der Mechanismus des Leitungsversagens untersucht. Beide Protokolle verbessern das Verständnis der Beziehung des peripheren Nervensystems mit Schmerzen.
Abstract
Die Singlefaseraufzeichnung war in den letzten Jahrzehnten aufgrund ihrer spezifischen Anwendung für Nervenfasern im zentralen und peripheren Nervensystem eine klassische und effektive elektrophysiologische Technik. Diese Methode ist besonders auf dorsale Wurzelganglien (DRG) anwendbar, die primäre sensorische Neuronen sind, die eine pseudo-unipolare Struktur von nervenaufworastrien Prozessen aufweisen. Die Muster und Merkmale der Aktionspotentiale, die entlang von Axonen weitergegeben werden, sind in diesen Neuronen nachweisbar. Die vorliegende Studie verwendet in vivo Singlefaser-Aufnahmen, um das Leitungsversagen von Ischiasnerven bei vollständig Freunds adjuvant (CFA)-behandelten Ratten zu beobachten. Da der zugrunde liegende Mechanismus nicht mit in vivo Singlefaser-Aufnahmen untersucht werden kann, werden Patch-Clamp-Aufnahmen von DRG-Neuronen auf Präparaten intakter DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv durchgeführt. Diese Aufnahmen zeigen eine positive Korrelation zwischen Leitungsversagen und der steigenden Steigung des Nachhyperpolarisationspotenzials (AHP) von DRG-Neuronen bei CFA-behandelten Tieren. Das Protokoll für in vivo Einzelfaser-Aufnahmen ermöglicht die Klassifizierung von Nervenfasern über die Messung der Leitungsgeschwindigkeit und die Überwachung von abnormalen Erkrankungen in Nervenfasern bei bestimmten Krankheiten. Intaktes DRG mit angeschlossenem peripheren Nerv ermöglicht die Beobachtung der Aktivität von DRG-Neuronen unter den meisten physiologischen Bedingungen. Abschließend ist die Singlefaseraufzeichnung in Kombination mit der elektrophysiologischen Aufzeichnung intakter DRGs eine effektive Methode, um die Rolle des Leitungsversagens während des analgetischen Prozesses zu untersuchen.
Introduction
Die normale Übertragung von Informationen entlang der Nervenfasern garantiert die normale Funktion des Nervensystems. Abnormale Funktion des Nervensystems spiegelt sich auch in der elektrischen Signalübertragung von Nervenfasern wider. Beispielsweise kann der Grad der Demyelination bei zentralen Demyelinationenläsionen durch Vergleich von Veränderungen der Nervenleitungsgeschwindigkeit vor und nach der Intervention anwendung1klassifiziert werden. Es ist schwierig, Nervenfasern intrazellulär aufzuzeichnen, außer bei speziellen Präparaten wie dem Tintenfischriesen Axon2. Daher ist die elektrophysiologische Aktivität nur über die extrazelluläre Aufzeichnung einzelner Fasern beschreibbar. Als eine der klassischen elektrophysiologischen Methoden hat die Singlefaseraufzeichnung eine längere Geschichte als andere Techniken. Allerdings greifen trotz ihrer umfangreichen Anwendung weniger Elektrophysiologen nach dieser Methode. Daher ist eine detaillierte Einführung des Standardprotokolls für die Singlefaseraufzeichnung für die entsprechende Anwendung erforderlich.
Obwohl verschiedene Patch-Clamp-Techniken die moderne elektrophysiologische Studie dominiert haben, spielt die Singlefaseraufzeichnung immer noch eine unersetzliche Rolle bei der Aufzeichnung der Aktivitäten von Nervenfasern, insbesondere Fasern, die periphere Empfindungen mit ihren Sinneszellkörper in Dorsalwurzelganglion (DRG). Der Vorteil der Verwendung von Singlefaser-Aufzeichnung hier ist, dass in vivo Faseraufzeichnung bietet eine lange Beobachtungszeit mit der Fähigkeit, Reaktionen auf natürliche Reize in präklinischen Modellen ohne Störung der intrazellulären Umgebung3 , 4.
Eine zunehmende Anzahl von Studien in den letzten zwei Jahrzehnten hat komplexe Funktionen entlang der Nervenfasern untersucht5, und Leitungsversagen, das als ein Zustand der erfolglosen Nervenimpulsübertragung entlang des Axons definiert ist, war in vielen verschiedenen periphere Nerven6,7. Das Vorhandensein von Leitungsversagen in unserer Untersuchung diente als intrinsischer Selbsthemmungsmechanismus für die Modulation persistenter nozizeptiver Eingaben entlang der C-Fasern8. Dieser Leitungsfehler wurde unter Bedingungen der Hyperalgesie4,9signifikant abgeschwächt. Daher kann die Ausrichtung auf die Faktoren, die an einem Leitungsversagen beteiligt sind, eine neue Behandlung für neuropathische Schmerzen darstellen. Um Leitungsfehler zu beobachten, sollte das Brennmuster auf der Grundlage sequenziell entladener Spitzen auf der Grundlage von Singlefaseraufzeichnungen aufgezeichnet und analysiert werden.
Um den Mechanismus des Leitungsversagens gründlich zu verstehen, ist es notwendig, die Transmissionseigenschaften des Axons, genauer gesagt, die Membraneigenschaften von DRG-Neuronen zu identifizieren, basierend auf ihren pseudo-unipolaren anatomischen Eigenschaften. Viele frühere Studien in diesem Bereich wurden an dissoziierten DRG-Neuronen10,11durchgeführt, die für die Untersuchung von Leitungsversagen aufgrund von zwei Hindernissen möglicherweise nicht durchführbar sind. Zunächst werden verschiedene mechanische und chemische Methoden im Dissoziationsprozess verwendet, um DRG-Neuronen zu befreien, was zu ungesunden Zellen führen oder den Phänotyp/die Eigenschaften der Neuronen verändern kann und die Befunde verwirrt. Zweitens werden die angeschlossenen peripheren Nerven im Grunde entfernt, und Leitungsversagen Phänomene sind in diesen Präparaten nicht beobachtbar. Daher wurde eine Vorbereitung von intakten DRG-Neuronen mit einem angeschlossenen Nerv verbessert, um die oben genannten Hindernisse zu vermeiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl neuere Studien Kalzium-Bildgebung von DRG-Neuronen in vivo16erreicht haben, bleibt die Durchführung von in vivo Patch-Clamp-Aufnahmen von einzelnen DRG-Nozizeptoren äußerst anspruchsvoll. Daher ist ein in vivo Singlefaser-Ansatz für das Schmerzfeld von anhaltendem Bedeutung. Die Einzelfaseraufzeichnung im vorliegenden Protokoll ermöglicht eine objektive Beobachtung von Leitungsversagensphänomenen, und die Kombination dieser Technik mit der in der aktuellen Studie entwickelten Ex-vivo-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der National Natural Science Foundation of China (31671089 und 81470060) und des Shaanxi Provincial Social Development Science and Technology Research Project (2016SF-250) unterstützt.
Materials
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
