CRISPR の遺伝子活性化を使用して長い Rna を過剰発現

最も生物医学研究、蛋白質のコーディングの成績に焦点を当て、転写されている遺伝子の大半は実際に非翻訳 Rna (Ensembl リリース 93) ので構成されます。現在の研究は、2007 年と 2017¹間に指数関数的に上昇病気プロセスの lncRNAs の出版物の数と、この分野を開拓し始めています。これらの出版物は、多くの lncRNAs が病気に関連付けられているを示しています。ただし、これらの lncRNAs の分子機構は Mrna と比べて多様な機能のための勉強は難しいです。疾患における lncRNAs の役割を理解することの問題を複合、lncRNAs はコーディング RNAs²よりも低いレベルで表されます。さらに、lncRNAs は、人間のセル行ベース テクニック³機能研究を制限する不完全、保存されます。これらの新規遺伝子のメカニズムを勉強する 1 つの方法は、培養細胞でそれらを内生ノザンすることです。過剰発現研究は特定の遺伝子の機能に関して重要な情報を提供し、重要な分子経路を分析する研究者を有効にできます。

LncRNA 遺伝子の転写をアクティブにする新しいメソッドは、ゲルバッチ研究室⁴によって最初に開発された CRISPR 技術に基づいています。このプロトコルは、lncRNA 生物学で使用するため、他のモデル システムにおけるこれらの遺伝子の表現のために適応されています。テクニックを過剰発現 CRISPR、CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) と呼ばれるタンパク質は Cas9 によって認識されるアンチセンス gRNA を介して DNA シーケンスへ送信できます。通常、Cas9 を誘発する DNA 切断;ただし、以前過剰発現手法の開発、Cas9 の突然変異は、このステップ⁵を非アクティブ化します。「死んだ」Cas9 に転写活性化因子を融合するとき (dCas9) 細胞に導入、lncRNAs の内因性の過剰発現は達成^4,6をすることができます。その他の転写因子、gRNA にバインドするを有効にする、gRNA に修正を加える添加 dCas9 遺伝子活性化システムの有効性を増加した 10 倍⁷。重要なは、近接転写活性化が必要であることを示した (< 200 bp)、転写開始サイト遺伝子、遺伝子の豊富なエリア⁷で特定アップレギュレーションを有効にします。CRISPR ノックアウト技術とは異なり dCas9 と gRNA のカセットは、複数世代にわたって過剰発現を保持する細胞では、ゲノムに統合する必要があります。これを達成する 1 つの方法は、レンチを使用して dCas9 と gRNA を含むカセットを統合することです。統合後、lncRNA の遺伝子発現を決定できます。

この記事で Jurkat T 細胞モデルにおける lncRNA 発現のためのプロトコルが表示されます。ステップバイ ステップの手順が表示され、また付着性のセルに適応することができます。