Mikrobiyal protein ve özel metabolit verilerinin analizi için açık kaynak MALDı TOF-MS ıdbac Pipeline kullanma
Summary
IDBac, bakteriyel kolonilerden kazınmış hücre malzemesinde toplanan, hem bozulmamış protein hem de özel metabolit spektrumlu verileri birleştiren açık kaynaklı Kütle Spektrometrisi bazlı Biyoinformatik boru hattıdır. Boru hattı araştırmacılar hızlı bir şekilde on binlerce bakteriyel koloniler Putatif taksonom gruplara düzenlemek için izin verir ve daha fazla özel metaboliti üretimi dayalı ayırt.
Abstract
Bakteri Phylogeny ve besin agar üzerinde büyüyen bakteriyel kolonilerin özel metaboliti üretimi arasındaki ilişkiyi görselleştirmek için, biz IDBac geliştirilen-düşük maliyetli ve yüksek verim Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş süresi kitle spektrometresi (MALDı-TOF MS) Biyoinformatik boru hattı. Idbac yazılımı olmayan uzmanlar için tasarlanmıştır, serbestçe kullanılabilir ve bakteriyel kolonilerin birkaç binlerce analiz yeteneğine sahiptir. Burada, MALDı-TOF MS analizi, MS enstrüman operasyonu ve ıdbac ‘de veri işleme ve görselleştirme için bakteriyel kolonilerin hazırlanması için prosedürler sunuyoruz. Özellikle, biz nasıl dendrograms içine protein MS parmak izleri dayalı ve interaktif metabolit Derneği Networks (MANs) özel metabolit verilerden oluşturmak bakteri küme kullanıcılara talimat.
Introduction
Bakteriyel fonksiyon Etüdü araştırmacılar için büyük bir engel hızlı ve eşzamanlı bir mikroorganizma ve özel metabolitleri üretmek için kapasitesini taksononomik kimliğini değerlendirmek yeteneğidir. Bu, ortamdan izole edilen bakterilerin çoğunda bakteriyel Phylogeny ve özel metabolit üretimi arasındaki ilişkiyi anlamada önemli gelişmeler önledi. Protein parmak izlerini grup olarak tanımlamak ve bakterileri belirlemek için kullanılan MS tabanlı yöntemler1,2,3,4, bu çalışmalar genellikle küçük izolatlar gruplarında gerçekleştirilmesine karşın, bir türe özgü şekilde. Önemlisi, özel metabolit üretimi hakkında bilgi, çevresel mikrobiyal fonksiyonun büyük bir sürücü, bu çalışmalarda dahil edilmemiş kaldı. Silva ve ark.5 son zamanlarda özel metabolitleri ve yazılım eksikliği mevcut Biyoinformatik darboğazları rahatlatmak için analiz etmek MALDI-TOF MS altkullanımı ayrıntılarıyla kapsamlı bir tarih sağladı. Bu eksiklikleri gidermek amacıyla, MALDı-TOF MS6‘ nın hem doğrusal hem de reflectron modlarını birleştiren bir Biyoinformatik boru hattı olan ıdbac ‘i oluşturduk. Bu kullanıcıların hızla görselleştirmek ve bakteri izolatlar hem protein ve özel metaboliti MS parmak izleri, sırasıyla dayalı ayırt sağlar.
Idbac uygun maliyetli, yüksek verimlilik ve Kullanıcı yatıyordu için tasarlanmıştır. Serbestçe kullanılabilir (chasemc.github.io/IDBac), ve sadece bir MALDı-TOF Kütle spektrometresi erişim gerektirir (reflectron modu özel metabolit analizi için gerekli olacaktır). Numune hazırlama basit “genişletilmiş doğrudan transfer” yöntemine dayanır7,8 ve veri tek bir Maldi-hedef noktada ardışık doğrusal ve reflectron alımları ile toplanır. Idbac ile, örnek hazırlama, veri edinme ve veri görselleştirme dahil olmak üzere dört saat içinde kolonilerin yüzlerce sözde Phylogeny ve özel metaboliti üretimini analiz etmek mümkündür. Bu, bakteri tanımlama (gen sıralaması gibi) ve metabolik çıktıyı analiz etme (sıvı kromatografi-kütle spektrometresi [LCMS] ve benzer kromatografik yöntemler) ile ilgili geleneksel yöntemlerle önemli bir zaman ve maliyet avantajı sunar.
Doğrusal mod analizinde elde edilen verileri kullanarak, ıdbac protein spektrumunun relatedness temsil etmek için hiyerarşik kümeleme kullanır. Spektrum çoğunlukla iyonize ribozomal proteinleri temsil ettiğinden, bir örnekteki fitogenetik çeşitliliğin bir gösterimini sağlar. Buna ek olarak, idbac metaboliti Derneği Networks (MANs) olarak özel metabolit parmak izleri görüntülemek için reflectron modu verileri içerir. MANs, bakteriyel izolatlar arasında ortak ve benzersiz metabolit üretiminin kolay görselleştirilmesini sağlayan iki taraflı ağlardan biridir. IDBac platformu, araştırmacılar hem protein hem de özel metabolit veri tandem aynı zamanda tek bir veri türü elde edilir, aynı şekilde analiz etmek için izin verir. Önemlisi, ıdbac Bruker ve Xiamen enstrümanların yanı sıra txt, sekme, CSV, mzXML ve mzML ham verileri işler. Bu, el ile dönüştürme ve veri kümeleri biçimlendirme gereksinimini ortadan kaldırır ve önemli ölçüde Kullanıcı hatası veya MS veri yanlış işleme riskini azaltır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Idbac protokol detayları bakteriyel protein ve özel metabolit veri edinme ve analiz kadar 384 bakteriyel izolatlar 4 h tek bir araştırmacı tarafından. Idbac ile bakteriyel izolatlar DNA ayıklamak veya sıvı fermantasyon et suyu özel metaboliti özler oluşturmak ve kromatografik yöntemleri kullanarak analiz etmek için gerek yoktur. Bunun yerine, protein ve özel metabolit verileri sadece bir MALDı hedef plaka üzerine doğrudan bakteriyel kolonilerden malzeme yayma tarafından toplanır. Bu, 16S rRNA gen sıralaması ve LCMS9gibi alternatif tekniklerle ilişkili zaman ve maliyeti büyük ölçüde azaltır.
MALDı plakasına bir matris boş ve kalibrasyon noktaları eklemek önemlidir ve yeniden üretilebilirliği ve istatistiksel güveni sağlamak için uygun sayıda çoğaltır kullanmanızı öneririz. Çoğaltır sayıları deneme bağımlı olacaktır. Örneğin, bir Kullanıcı çevresel çeşitlilik plakaları koleksiyonundan binlerce kolonileri ayırt etmek niyetinde ise, daha az çoğaltır gerekli olabilir (laboratuvarımız koloni başına üç teknik çoğaltır toplar). Alternatif olarak, bir Kullanıcı belirli bakteriyel takson ‘dan gelen suşların özel bir veritabanı oluşturmak istiyorsa, bilinmeyen izolatların alt türler sınıflandırmalarını hızla belirlemek için daha fazla çoğaltır uygundur (laboratuvarımız her bir sekiz biyolojik çoğaltır toplar strain).
IDBac hızlı bir şekilde son derece ilgili bakteriyel izolatlar Putatif taksonom bilgi ve özel metabolit üretimi dayalı ayırt etmek için bir araçtır. Derinlemesine genetik analizler, metabolit üretimi ve fonksiyonuyla ilgili çalışmalar veya nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ve/veya özel metabolit yapısının karakterize edilmesi gibi ortogonal yöntemlerle öncü olarak hizmet verebilir LC-MS/MS.
Özel metabolit üretimi (ıdbac MANs), özellikle yöntemin potansiyel bir sınırlama olan farklı medya kullanarak, bakteriyel büyüme koşullarına son derece duyarlıdır. Ancak bu özellikleri Kullanıcı tarafından istismar edilebilir, ıdbac kolayca büyüme koşulları çeşitli altında özel metaboliti üretiminde farklılıkları gösteren MANs üretebilir gibi. Özel metaboliti parmak izi büyüme durumuna göre değişebilir iken, daha önce protein parmak izleri bu değişkenler arasında nispeten kararlı kaldığını göstermiştir dikkat etmek önemlidir (bkz. Clark ve al.6). Çevresel çeşitlilik plakaları ile uğraşırken, komşu bakteriyel çapraz konuşma olası katkıları azaltmak için analiz öncesinde bakteriyel izolatlar arındırmak öneririz.
Son olarak, protein MS parmak izleri aranabilir bir genel veritabanı eksikliği bilinmeyen çevresel bakterileri sınıflandırmak için bu yöntemin kullanımı büyük bir eksiklik olduğunu. Biz bu akılda ıdbac oluşturuldu ve bir topluluk kabul açık kaynak formatı (mzml)10,11,12 içine veri otomatik dönüşüm dahil ve arama, paylaşım ve oluşturulması izin vermek için yazılım tasarlanmış özel veritabanları. Biz büyük bir kamu veritabanı oluşturma sürecinde (> 10000 tam olarak karakterize suşları), hangi türler için bazı izolatlar sınıflandırılması için izin verecektir düzeyi, GenBank üyelik numaraları kullanılabilir olduğunda bağlantılar da dahil olmak üzere.
Idbac açık kaynak ve kod herkes kendi veri analizi ve görselleştirme ihtiyaçlarını özelleştirmek için kullanılabilir. Kullanıcıların deneysel hedeflerini desteklemesine ve tasarlamalarına yardımcı olmak için geniş bir literatür gövdesine (Sauer vd.7, Silva ve al.5) danışmanızı öneririz. Biz tartışma için bir forum barındırıyoruz: https://groups.Google.com/forum/#!forum/idbac ve yazılım ile ilgili sorunları bildirmek için bir araç: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma ulusal genel Tıp Bilimleri Enstitüsü Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17 tarafından destekleniyordu; İzlanda araştırma fonu Grant 152336-051; ve University of Illinois Chicago başlangıç fonları. Ayrıca, aşağıdaki katılımcılar teşekkür: Dr Amanda bulman MALDı-TOF MS protein edinme parametreleri ile yardım için; Dr. Terry Moore ve Dr. Atul Jain rerystallizing Alfa-Cyano-4-hidroxycinnamic asit matris (CHCA) için.
Materials
| Acetonitrile | Fisher | 60-002-65 | LC-MS Ultra CHROMASOLV |
| Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument | Bruker Daltonics | ||
| Bruker Daltonics Bacterial test standard | Fisher | NC0884024 | Bruker Daltonics 8604530 |
| Bruker Peptide Calibration standard | Fisher | NC9846988 | Bruker Daltonics 8206195 |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | 99.5+%, Optima LC/MS Grade |
| MALDI-TOF target Plate | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemical | A456-500 | Optima LC/MS Grade |
| Toothpicks | any is ok | ||
| Trifluoroacetic acid | Fisher | AC293810010 | 99.5%, for biochemistry, ACROS Organics |
| Water | VWR | 7732-18-5 | LC-MS |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | (C2020-25G) ≥98% (TLC), powder |
References
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
- Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).
- Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).
- Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists. Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).
- Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis. Planta Medica. 82, 671-689 (2016).
- Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).
- Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).
- Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., Böttger, E. C., Hombach, M. Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).
- Schumann, P., Maier, T. MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria. Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).
- Chambers, M. C., Maclean, B., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).
- Martens, L., Chambers, M., et al. mzML-a community standard for mass spectrometry data. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).
