Использование трубопровода MALDI TOF-MS IDBac с открытым исходным кодом для анализа микробного белка и специализированных метаболитных данных
Summary
IDBac является открытым исходным кодом масс-спектрометрии основе биоинформатики трубопровода, который объединяет данные из нетронутых белков и специализированных метаболитов спектра, собранные на клеточном материале Царапины из бактериальных колоний. Трубопровод позволяет исследователям быстро организовать сотни до тысячи бактериальных колоний в таксономические группы, и далее дифференцировать их на основе специализированного производства метаболита.
Abstract
Для того, чтобы визуализировать связь между бактериальной филогенией и специализированным производством метаболитов бактериальных колоний, растущих на питательном агаре, мы разработали IDBac – недорогой и высокопроизводительный матричной матрицы при поддержке лазерной дезорпации/ионизации биоинформатика времен полета (MALDI-TOF MS). Программное обеспечение IDBac предназначено для неспециалистов, находится в свободном доступе и способно анализировать от нескольких до тысяч бактериальных колоний. Здесь мы представляем процедуры для подготовки бактериальных колоний для анализа MALDI-TOF MS, операции MS прибора, а также обработки и визуализации данных в IDBac. В частности, мы проинструктируем пользователей, как группировать бактерии в дендрограммы на основе отпечатков пальцев белка MS и интерактивно создавать метаболитассоциации сетей (MANs) из специализированных данных метаболита.
Introduction
Основным препятствием для исследователей, изучающих бактериальную функцию, является способность быстро и одновременно оценивать таксономическую идентичность микроорганизма и его способность производить специализированные метаболиты. Это предотвратило значительные достижения в понимании взаимосвязи между бактериальной филогенией и специализированным производством метаболитов в большинстве бактерий, изолированных от окружающей среды. Хотя MS-методы, которые используют отпечатки пальцев белка для группы и выявления бактерий хорошо описаны1,2,3,4, эти исследования, как правило, были выполнены на небольших группах изолятов, в видовой манере. Важно отметить, что информация о специализированном производстве метаболитов, который является основным фактором микробной функции в окружающей среде, в этих исследованиях остается неинкорпорированной. Сильва и др.5 недавно представили всеобъемлющую историю с подробным описанием недостаточного использования MALDI-TOF MS для анализа специализированных метаболитов и нехватки программного обеспечения для облегчения текущих узких мест биоинформатики. Для устранения этих недостатков мы создали IDBac, конвейер биоинформатики, который интегрирует как линейные,так и отражающие режимы MALDI-TOF MS 6. Это позволяет пользователям быстро визуализировать и дифференцировать бактериальные изоляты на основе белка и специализированных метаболитных MS отпечатков пальцев, соответственно.
IDBac является экономически эффективным, высокой пропускной записи, и предназначен для неспециалистов. Он находится в свободном доступе (chasemc.github.io/IDBac) и требует доступа только к масс-спектрометру MALDI-TOF (режим отражательного режима потребуется для специализированного метаболита). Подготовка образцов основывается на простомметоде “расширенной прямой передачи” 7,8 иданные собираются с последовательными линейными и отражательными приобретениями на одном месте MALDI-целевой. С помощью IDBac можно проанализировать предохранение от филогении и специализированного производства метаболитов в сотнях колоний менее чем за четыре часа, включая подготовку образцов, получение данных и визуализацию данных. Это представляет собой значительное временное и затратное преимущество по сравнению с традиционными методами выявления бактерий (таких как секвенирование генов) и анализа метаболического выхода (жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LCMS) и аналогичных хроматографических методов).
Используя данные, полученные в линейном режиме анализа, IDBac использует иерархическую кластеризацию для представления родственности белковых спектров. Поскольку спектры в основном представляют ионизированные рибосомные белки, они обеспечивают представление филогенетического разнообразия, присутствующее в образце. Кроме того, IDBac включает данные отражательного режима для отображения специализированных метаболитных отпечатков пальцев в виде сетей метаболитной ассоциации (MANs). MAN представляют собой двухсторонние сети, которые позволяют легко визуализировать совместное и уникальное производство метаболитов между бактериальными изолятами. Платформа IDBac позволяет исследователям анализировать как белковые, так и специализированные метаболитовые данные в тандеме, но также индивидуально, если приобретен только один тип данных. Важно отметить, что IDBac обрабатывает необработанные данные с инструментов Bruker и Xiamen, а также txt, tab, csv, mzXML и mzML. Это устраняет необходимость ручного преобразования и форматирования наборов данных и значительно снижает риск ошибки пользователя или неправильного обращения с данными MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол IDBac детализирует бактериальный белок и специализированные метаболитные данные по сбору и анализу до 384 бактериальных изолятов в 4 ч одним исследователем. С IDBac нет необходимости извлекать ДНК из бактериальных изолятов или генерировать специализированные экстракты метаболита из жидкого брожения бульонов и анализировать их с помощью хроматографических методов. Вместо этого, белок и специализированные данные метаболита собираются просто распространяя материал из бактериальных колоний непосредственно на целевую пластину MALDI. Это значительно сокращает время и затраты, связанные с альтернативными методами, такимикак секвенирование генов 16S rRNA и LCMS 9.
Важно добавить в пластину MALDI матричные пустые и калибровочные пятна, и мы рекомендуем использовать соответствующее количество репликантов для обеспечения воспроизводимости и статистической достоверности. Количество репликатов будет зависеть от экспериментов. Например, если пользователь намеревается отличить тысячи колоний от коллекции тарелок экологического разнообразия, может потребоваться меньше репликаторов (наша лаборатория собирает три технических реплика на одну колонию). Кроме того, если пользователь хочет создать пользовательскую базу данных штаммов от конкретных бактериальных таксонов для быстрого определения подвидов классификаций неизвестных изолятов, то больше репликаций являются целесообразными (наша лаборатория собирает восемь биологических репликаторов на деформации).
IDBac является инструментом для быстрой дифференциализации высоко связанных бактериальных изолятов на основе ожидаемой таксономической информации и специализированного производства метаболитов. Он может дополнять или служить предшественником ортогональных методов, таких как углубленный генетический анализ, исследования, связанные с производством и функцией метаболита, или характеристика специализированной структуры метаболита с помощью ядерной магнитно-резонансной спектроскопии и/или LC-MS/MS.
Специализированное производство метаболитов (IDBac MANs) очень восприимчиво к бактериальным условиям роста, особенно с использованием различных носителей, что является потенциальным ограничением метода. Однако эти черты могут быть использованы пользователем, так как IDBac может легко генерировать MANs, показывающие различия в специализированном производстве метаболитов в различных условиях роста. Важно отметить, что в то время как специализированные метаболитовые отпечатки пальцев могут варьироваться в зависимости от состояния роста, мы ранее показали, что отпечатки белка остаются относительно стабильными по этим переменным (см. Clark et al.6). При работе с тарелость разнообразия окружающей среды, мы рекомендуем очищать бактериальные изоляты до анализа, чтобы уменьшить возможные вклады от соседних бактериальных перекрестных разговоров.
Наконец, отсутствие поисковой общедоступной базы данных отпечатков пальцев белка MS является одним из основных недостатков в использовании этого метода для классификации неизвестных экологических бактерий. Мы создали IDBac с учетом этого и включили автоматизированное преобразование данных в общепринятый формат с открытым исходным кодом (mzML)10,11,12 и разработали программное обеспечение, позволяющее осуществлять поиск, обмен и создание пользовательские базы данных. Мы находимся в процессе создания большой публичной базы данных (10 000 полностью охарактеризованных штаммов), которая позволит классифицировать некоторые изоляты на уровне видов, включая ссылки на номера присоединений GenBank при наличии.
IDBac является открытым исходным кодом, и код доступен для всех, чтобы настроить свои потребности анализа данных и визуализации. Мы рекомендуем пользователям проконсультироваться с обширным объемомлитературы (Sauer et al. 7, Silva et al.5),чтобы помочь поддержать и разработать свои экспериментальные цели. Мы проводим форум для обсуждения по адресу: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac и средства для сообщения о проблемах с программным обеспечением по адресу: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук Грант R01 GM125943, National Geographic Грант CP-044R-17; Исландский исследовательский фонд Грант 152336-051; и Иллинойский университет в Чикаго стартап-фондов. Кроме того, мы благодарим следующих участников: д-р Аманда Булман за помощь в приобретении белка MALDI-TOF MS; Д-р Терри Мур и д-р Атул Джайн для рекристаллизации альфа-циано-4-гидроксициннамической кислотной матрицы (CHCA).
Materials
| Acetonitrile | Fisher | 60-002-65 | LC-MS Ultra CHROMASOLV |
| Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument | Bruker Daltonics | ||
| Bruker Daltonics Bacterial test standard | Fisher | NC0884024 | Bruker Daltonics 8604530 |
| Bruker Peptide Calibration standard | Fisher | NC9846988 | Bruker Daltonics 8206195 |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | 99.5+%, Optima LC/MS Grade |
| MALDI-TOF target Plate | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemical | A456-500 | Optima LC/MS Grade |
| Toothpicks | any is ok | ||
| Trifluoroacetic acid | Fisher | AC293810010 | 99.5%, for biochemistry, ACROS Organics |
| Water | VWR | 7732-18-5 | LC-MS |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | (C2020-25G) ≥98% (TLC), powder |
References
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
- Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).
- Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).
- Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists. Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).
- Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis. Planta Medica. 82, 671-689 (2016).
- Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).
- Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).
- Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., Böttger, E. C., Hombach, M. Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).
- Schumann, P., Maier, T. MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria. Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).
- Chambers, M. C., Maclean, B., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).
- Martens, L., Chambers, M., et al. mzML-a community standard for mass spectrometry data. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).
