Utilizzo della pipeline OPEN-Source MALDI TOF-MS IDBac per l'analisi dei dati sulle proteine microbiche e sui metaboliti specializzati

1. Preparazione della matrice MALDI Preparare 10 mg/mL di acido MALDI- e/o riconfondibile di z-cyano-4-idrossicinnamici (CHCA) in solventi MS-grade: 50% acetonitrile (ACN), 47,5% di acqua (H2O), 2,5% di acido trifluoroacetico (TFA). Esempio: 100 soluzione ll : 50 ACN – 47,5 S L H2O Preparare almeno 1 l di soluzione a matrice per punto di piastra e vortice MALDI o sonicare fino a quando non è in soluzione (circa 5 minimi o nessun solido visibile).PRUDENTE: TFA è un acido forte che deve essere maneggiato in un cappuccio del fumi chimico mentre indossa un’adeguata attrezzatura protettiva personale, in quanto può danneggiare la pelle, gli occhi e le vie aeree con contatto o inalazione.NOTA: CHCA è igroscopica e sensibile alla luce e deve essere conservata in fiale d’ambra in un desiccatore. Sono disponibili molte opzioni di matrice MALDI. CHCA è più comune per la profilazione delle proteine dei batteri, ma funziona anche per l’analisi specializzata dei metaboliti. La selezione della matrice dipende dalle esigenze individuali dell’utente/esperimento. 2. Preparazione di piastre bersaglio MALDI NOTA: Vedere Sauer et al.7, per maggiori dettagli. Risciacquare la piastra MALDI con metanolo (grado HPLC o superiore) e asciugare con salviette di carta morbida. Non utilizzare spazzole abrasive durante la pulizia delle piastre bersaglio, in quanto ciò può danneggiare in modo permanente la superficie della piastra bersaglio. Assegnare macchie di calibro proteico e metabolita specializzato. Organizzare i punti di calibrazione in modo uniforme tra la popolazione campione, per tenere conto delle irregolarità della piastra MALDI e della deriva degli strumenti nel tempo. Assegnare un numero adeguato di punti media/matrice-vuoti per lo studio; questi spot conterranno solo supporti e matrici, o solo matrice. Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, trasferire una piccola porzione di una colonia batterica nel punto appropriato della piastra MALDI. Diffondere la colonia batterica in modo uniforme sul posto. Il punto dovrebbe apparire il più piatto possibile.NOTA: Sarà più facile appiattire le colonie batteriche che sono più mucoide/ amorfo. Per colonie più rigide/solide, evitare di lasciare gruppi visibili di massa cellulare nello spot MALDI (Figura 1). Figura 1: piastra bersaglio MALDI che mostra due diversi isolati prima di aggiungere acido formico e matrice MALDI (primi 3 punti – Bacillus sp.; 3 punti inferiori – Streptomyces sp.). Per entrambi, la colonna 3 rappresenta il campione in eccesso; la colonna 2 rappresenta la quantità appropriata di campione; colonna 1 rappresenta un campione insufficiente per l’analisi MALDI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Preparare un controllo matrice/supporto utilizzando uno stuzzicadenti sterile per trasferire una quantità minima di agar/media sui punti appropriati sulla piastra MALDI. Sovrapporre 1 L di 70% di spettrometria di massa grado acido formico su ogni punto campione, compresi i punti di controllo della matrice. Lasciare asciugare completamente l’acido in una cappa di fumi chimici (circa 5 min).AVVISO: L’acido formico è una sostanza chimica caustica e deve essere maneggiato in cappe di fumi chimici. Può danneggiare le vie respiratorie se inalato. Aggiungere 1 l della soluzione di matrice MALDI preparata a ogni punto campione, nonché agli spot di controllo matrice/media. Lasciare asciugare completamente la soluzione a matrice (circa 5 min).NOTA: È possibile conservare la piastra in un desiccatore, al buio, fino a quando non può essere analizzata su uno spettrometro di massa MALDI-TOF. I tempi di archiviazione consentiti possono variare a seconda della stabilità del campione. Aggiungere il calibro da 0,5 a 1,0 l’area ai punti di calibrazione assegnati, seguito da una soluzione di matrice MALDI. Pipette la soluzione risultante su e giù per mescolare. Lasciare asciugare completamente tutti i punti prima dell’introduzione nello spettrometro di massa MALDI-TOF.NOTA: La proteina e i calibratori dei metaboliti specializzati devono essere aggiunti entro 30 min dall’analisi MALDI, in quanto entrambi sono suscettibili alla degradazione. 3. Acquisizione dei dati NOTA: i parametri generali per l’acquisizione dei dati sono elencati nella Tabella 1. parametro proteina Metabolita specializzato Inizio massa (Da) 1920 60 del sistema Fine massa (Da) 21000 2700 Deflessione di massa (Da) 1900 50 anni Colpi 500 1000 Frequenza (Hz) 2000 2000 Dimensioni laser l f inv medio MaxStdDev (ppm) 300 30 milio Tabella 1. Seguendo i protocolli specifici per lo strumento utilizzato, impostare sia le calibrazioni proteiche che metabolite specializzate. Testare alcuni punti bersaglio separati per determinare la potenza ottimale del laser e il guadagno del rivelatore da utilizzare durante l’acquisizione di spettri (questo varierà giorno per giorno e per strumento).NOTA: Figura 2A e Figura 3A mostrano spettri ottimali, mentre Figura 2D e Figura 3D sono esempi di spettri di scarsa qualità. Figura 2: Esempio di spettri proteici che mostrano l’effetto della modifica della potenza laser e del guadagno del rivelatore. La qualità degli spettri è migliore nel pannello A, e diminuisce fino a quando insufficiente qualità degli spettri nei pannelli C e D. Mentre lo spettro nel pannello B può comportare picchi utilizzabili, il pannello A visualizza i dati ottimali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Esempio di spettri di metaboliti specializzati che mostrano l’effetto della modifica della potenza laser e del guadagno del rivelatore. La qualità degli spettri è migliore nel pannello A e diminuisce fino a quando non è insufficiente la qualità degli spettri nei pannelli C e D. Mentre lo spettro nel pannello B può comportare picchi utilizzabili, il pannello A visualizza i dati ottimali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Acquisire spettri, salvare gli spettri proteici in una cartella e gli spettri di metaboliti specializzati in una seconda cartella separata. 4. Pulizia della piastra bersaglio MALDI (adattata da Sauer et al.7) Rimuovere la piastra bersaglio MALDI dal supporto e risciacquare con acetone. Lavare con un sapone liquido non abrasivo per rimuovere proteine traccia e lipidi, e salviette di carta morbida / spazzolino a setole morbide. Risciacquare con acqua de-ionizzata per circa 2 min per rimuovere completamente il sapone. Sonicare la piastra bersaglio in acqua (grado HPLC o superiore) per 5 min. Sciacquare la piastra bersaglio con acqua (grado HPLC o superiore). Risciacquare la piastra bersaglio con metanolo (grado HPLC o superiore). 5. Installazione del software IDBac Scaricare il software IDBac.NOTA: per il download sono disponibili anche backup permanenti con versione (vedere la Tabella dei materiali). Fare doppio clic sul scaricato “Install_IDBac.exe” per avviare il programma di installazione e seguire le istruzioni visualizzate. 6. A partire dai dati grezzi NOTA: le spiegazioni dettagliate e le istruzioni di ogni fase di elaborazione dei dati sono incorporate all’interno di IDBac, tuttavia le principali analisi e input interattivi sono descritti di seguito. Fare doppio clic sul collegamento sul desktop IDBac per avviare IDBac. IDBac verrà aperto nella scheda Introduzione per impostazione predefinita. Utilizzare il pulsante Controlla aggiornamenti per assicurarsi che venga utilizzata la versione più recente di IDBac (richiede l’accesso a Internet). Se è disponibile una versione più recente, IDBac scaricherà e installerà automaticamente l’aggiornamento, dopo di che IDBac richiederà di riavviare. Fare clic sulla scheda Inizia con dati non elaborati e scegliere dal menu il tipo di dati da utilizzare con IDBac; continuare seguendo le istruzioni in-app. Durante l’impostazione della conversione e dell’elaborazione dei file di dati, immettere un nome descrittivo per l’esperimento nel caso richiesto (vedere la Figura4). Gli esperimenti verranno successivamente visualizzati in ordine alfabetico, pertanto una strategia utile consiste nell’iniziare i nomi degli esperimenti con un attributo di gruppo (ad esempio, “bacillus-trials_experiment-1”; “bacillus-trials_experiment-2”). Figura 4: passaggio di conversione e pre-elaborazione dei dati IDBac. IDBac converte gli spettri non elaborati nel formato mzML aperto e archivia mzML, elenchi di picco e informazioni di esempio in un database per ogni esperimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 7. Lavorare con esperimenti precedenti Dopo aver convertito i file e averli elaborazione con IDBac o in qualsiasi momento si desidera analizzare nuovamente un esperimento, passare alla pagina Utilizzo degli esperimenti precedenti e selezionare un esperimento con cui lavorare ( Figura5). Figura 5: pagina “Lavorare con esperimenti precedenti”. Utilizza la pagina “Lavora con esperimenti precedenti” di IDBac per selezionare un esperimento da analizzare o modificare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. (Facoltativo) Aggiungere informazioni sugli esempi utilizzando il menu Fare clic qui per modificare l’esperimentoselezionato. Immettere le informazioni nel foglio di calcolo compilato automaticamente e premere Salva (Figura 6). Questa opzione consente all’utente di colorare i dati durante le analisi. Figura 6: Immettere informazioni di esempio. All’interno della pagina “Utilizzo di esperimenti precedenti” gli utenti possono inserire informazioni su campioni come l’identità tassonomica, la posizione di raccolta, le condizioni di isolamento, ecc. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. (Facoltativo) Trasferire tutti i campioni o un sottoinsieme di campioni in un esperimento nuovo o in un altro esperimento facendo clic su Trasferisci campioni da esperimenti precedenti a esperimenti nuovi/altri e seguendo le istruzioni fornite (Figura 7). Figura 7: Trasferire i dati. La pagina “Utilizzo di esperimenti precedenti” contiene l’opzione per trasferire dati tra esperimenti esistenti e a nuovi esperimenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Quando si è pronti per iniziare l’analisi, assicurarsi che sia selezionato l’esperimento con cui lavorare. Selezionare Analisi dati proteine o Analisi dati molecola piccola. 8. Impostazione dell’analisi dei dati delle proteine e creazione di grafici a specchio Se si analizzano i dati delle proteine, passare innanzitutto alla pagina Analisi dei dati delle proteine. Scegliere le impostazioni di raccolta del picco e valutare gli spettri proteici dei campioni tramite i grafici a specchio visualizzati (Figura 8).NOTA: Nei grafici a specchio, un picco rosso indica la presenza di tale picco solo nello spettro superiore, mentre i picchi blu rappresentano quelli che si verificano in entrambi gli spettri. Figura 8: Scegliere la modalità di conservazione dei picchi per l’analisi. Dopo aver selezionato un esperimento da analizzare, visitando la pagina “Analisi dei dati proteici” e successivamente aprendo il menu “Scegli come vengono mantenuti i picchi per l’analisi” consente agli utenti di scegliere impostazioni come il rapporto segnale-rumore per mantenere i picchi. Il grafico speculare visualizzato (o dendrogramma) si aggiornerà automaticamente per riflettere le impostazioni scelte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Regolare la percentuale di repliche in cui deve essere presente un picco per poter essere incluso per le analisi (ad esempio, se la soglia è impostata al 70% e si verifica un picco in almeno 7 repliche su 10, verrà incluso). Utilizzando le trame a specchio come guida visiva, regolare il segnale al taglio del rumore che mantiene i picchi più “genuini” e il minor rumore, notando che più repliche e un valore più alto di “presenza di picco percentuale” permetterà la selezione di un segnale inferiore al taglio del rumore. Specificare i tagli m/z inferiori e superiori, dettando l’intervallo di valori di massa all’interno di ogni spettro da utilizzare in ulteriori analisi da IDBac. 9. Clustering di campioni utilizzando i dati delle proteine Nella pagina Analisi dati proteine, selezionare la scheda Dendrogram. Ciò consente di raggruppare i campioni in un dendrogramma in base alle misure di distanza selezionate dall’utente e agli algoritmi di clustering. Fare clic su Seleziona campioni nel menu e seguire le istruzioni per selezionare i campioni da includere nelle analisi. Solo i campioni che contengono spettri proteici verranno visualizzati all’interno della casella Campioni disponibili (Figura9). Figura 9: Selezionare i campioni dell’esperimento scelto da includere all’interno del dendrogramma visualizzato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Utilizzare i valori predefiniti oppure, in Scegli impostazioni di clustering, selezionare gli algoritmi di distanza e clustering desiderati da applicare alla generazione del dendrogramma. Selezionare Presenza/Assenza come input. In alternativa, se si è certi delle altezze di picco dei campioni (ad esempio, dopo aver eseguito uno studio per valutare la variabilità dell’intensità di picco), selezionare Intensità come input.NOTA: al momento della pubblicazione, IDBac offre flessibilità nelle impostazioni per il clustering, affidandosi agli utenti per scegliere le combinazioni appropriate. Se non ha familiarità con queste opzioni, si consiglia di accoppiare a: distanza “cosina” e clustering “media (UPGMA)”; o B: distanza “euclideo” e clustering “Ward.D2”. Per visualizzare i valori bootstrap nel dendrogramma, immettere un numero compreso tra 2 e 1000 in Bootstraps. Quando si segnalano i risultati, copiare il testo all’interno del paragrafo Suggerimenti per la segnalazione dell’analisi delle proteine. Fornisce le impostazioni definite dall’utente che hanno generato il dendrogramma specifico. 10. Personalizzazione del dendrogramma proteico Per iniziare a personalizzare il dendrogramma, aprire il menu Regola dendrogramma (Figura10). Figura 10: Regolare il dendrogramma. IDBac fornisce alcune opzioni per modificare l’aspetto del dendrogramma, questi possono essere trovati all’interno del menu “Regolare il dendrogramma”. Ciò include la colorazione di rami ed etichette con k-mezzi, o “tagliando” il dendrogramma ad un’altezza fornita dall’utente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Per colorare le linee e/o le etichette del dendrogramma selezionare il pulsante appropriato: fare clic per modificare le linee o Fare clic per modificare le etichette e selezionare le opzioni desiderate. Per stampare le informazioni dal foglio di calcolo accanto al dendrogramma (vedere il passaggio 7.2), selezionare il pulsante Incorpora informazioni sugli esempi. Si aprirà un pannello in cui una categoria (colonna nel foglio di calcolo) si autoposta in base ai valori immessi (Figura 11). Figura 11: Incorporare informazioni sui campioni. All’interno del menu “Regola il Dendrogram” è l’opzione “Incorpora informazioni sui campioni”. Selezionando questa opzione si consentiranno di tracciare le informazioni sui campioni accanto al dendrogramma. Le informazioni di esempio vengono immesse nella pagina “Utilizzo di esperimenti precedenti”. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 11. Inserire campioni da un esperimento separato nel dendrogramma Per inserire campioni da un altro esperimento, seleziona il pulsante di menu Inserisci campioni da un altro esperimento. Seguire le istruzioni nel pannello appena aperto (Figura 12). Figura 12: Inserire campioni dal menu Un altro esperimento. A volte è utile confrontare i campioni di un altro esperimento. Usa il menu “Inserisci campioni da un altro esperimento” per scegliere i campioni da includere all’interno del dendrogramma attualmente visualizzato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 12. Analisi dei dati specializzati sui metaboliti e sulle reti di associazione dei metaboliti (MAN) Procedere alla pagina Metabolite Association Network (Small-Molecule). Questa pagina consente la visualizzazione dei dati mediante l’analisi dei componenti principali (PCA) e i MAN, che utilizzano reti bipartite per visualizzare la correlazione di piccoli valori di molecola m/z con campioni. Se è stato creato un dendrogramma proteico (sezione 9), verrà visualizzato anche in questa pagina. Fare clic e trascinare sul dendrogramma per evidenziare i campioni selezionati di interesse da analizzare. Se non vengono evidenziati campioni o non viene creato alcun dendrogramma proteico, verrà visualizzato un MAN di un sottoinsieme casuale o tutti i campioni rispettosamente (Figura 13). Figura 13: Pagina Analisi dei dati delle piccole molecole”. Se un dendrogramma è stato creato da spettri proteici, verrà visualizzato all’interno della pagina “Small Molecule Data Analysis”. Questa pagina mostrerà anche Metabolite Associate Networks (MAN) e Principle Components Analysis (PCA) per piccoli dati di molecola. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Per sottrarre una matrice/supporto vuoto nell’UOMO, aprire il menu Selezionare un campione da sottrarre e scegliere il campione appropriato da utilizzare come vuoto. Aprire il menu Mostra/Nascondi impostazioni MAN per selezionare i valori desiderati per la percentuale di presenza massima in repliche, segnale al rumore e tagli di massa superiori e inferiori di massa, come è stato fatto per gli spettri proteici nella Sezione 9. Utilizzare i piccoli grafici a specchio molecolare per guidare la selezione di queste impostazioni. Selezionare “Scarica dati di rete correnti” per salvare i dati dell’UOMO attualmente visualizzato. Questi dati possono essere utilizzati in software di analisi di rete diverso da IDBac. Per i risultati dei report, copiare il testo all’interno del paragrafo Suggerimenti per la creazione di report di analisi MAN. In questo modo vengono fornite le impostazioni definite dall’utente utilizzate per generare l’oggetto MAN creato. 13. Condivisione dei dati Ogni “esperimento” IDBac viene salvato come un singolo database SQLite. Contiene gli spettri non elaborati mzML convertiti, i picchi rilevati e tutte le informazioni di input dell’utente sui campioni. Pertanto, per condividere un esperimento IDBac è sufficiente condividere il file SQlite con lo stesso nome dell’esperimento (la posizione del file viene visualizzata nella pagina Utilizzo di esperimenti precedenti).