Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs
Summary
Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.
Abstract
Rekombinant virüs kullanımı temel veya uygulamalı Viroloji çok önemli olmuştur. Ters genetik hem viral çoğaltma mekanizması çözmeye ve antiviral ilaçlar ya da aşılar için geliştirme platformu sağlamak için son derece güçlü bir teknoloji olduğu kanıtlanmış. İnşaat ve bir negatif iplikçikli RNA virüsü gibi solunum sinsisyal virüs (RSV) için ters bir genetik sistemi by pass iddiası ancak, hassas kalır ve özel bilgi birikimi gerektirir. RSV genomu yaklaşık 15 KB hem viral RNA ve transkripsiyonu için bir şablon olarak hizmet veren bir tek iplikçikli, negatif anlamda RNA büyüktür. Ters genetik sistemimiz insan RSV uzun zorlanma genom (HRSV) cDNA kopyasını kullanır. Bu cDNA yanı sıra viral proteinlerin polimeraz karmaşık kodlama cDNAs (L, P, N ve M2-1), bireysel ifade vektörel çizimler T7 polimeraz kontrol dizilerini altında yer alır. Bu unsurların stabil T7 polimeraz hızlı, BSR-T7/5 hücrelerdeki transfection sitoplazmik ve rekombinant RSV transkripsiyonu için genetik olarak değiştirilmiş virions sebebiyet veren sağlar. Hücre yüzeyinde ve kültür süpernatant BSRT7/5, yeni bir RSV viral amplifikasyon için insan HEp-2 hücreleri enfekte için toplanıyor. Amplifikasyon iki veya üç mermi 1 x 106 -1 x 107 plak oluşturan birimler (PFU) içeren viral hisse senetleri almaları gerektiğini / mL. En uygun hasat, donma ve viral stoklarının titrasyon için yöntemler burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Biz burada iki rekombinant virüs ücretsiz yeşil flüoresan protein (GFP) (RSV-GFP) sırasıyla ifade oluşturma tarafından sunulan Protokolü göstermek veya viral M2-1 GFP (RSV-M2-1-GFP) erimiş. RSV GFP RSV çoğaltma ve RSV-M2-1-viral yapılarını gibi viral protein dynamics canlı hücrelerdeki video mikroskobu teknikleri kullanarak görselleştirmek için GFP ölçmek için nasıl kullanılacağını gösterir.
Introduction
İnsan RSV bebekler dünya çapında1‘ yatış akut solunum yolu enfeksiyonu için önde gelen nedenidir. Buna ek olarak, RSV erişkinlerde grip için karşılaştırılabilir ile hastaneye yatış ve mortalite yükü yaşlı2‘ deki en önemli hastalık yükü ile ilişkilidir. Var hiçbir aşı ya da belirli antiviral ilaçlar kullanılabilir RSV karşı ama umut verici henüz yeni ilaçlar çoğu geliştirme3,4‘ te. Karmaşıklığı ve miktar RSV çarpma teknikleri ağırlık antiviral ilaçlar veya geçerli önemli çabalara rağmen aşılar için arama engel. RSV çarpma tüp bebek miktar genellikle çoğunlukla cytopathic etkisi analizinde mikroskobu, immunostaining, plak azaltma tarafından deneyleri, nicel grafiklerden zahmetli, zaman alıcı ve pahalı yöntemler üzerinde dayanır ters transkriptaz (qRT)-Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ve enzim bağlı immunosorbent assay testleri. Virüs genleri değiştirilmiş ve bu gibi muhabir gen ifade ile GFP için kodlama, böyle gösterimleri için daha uygundur. Otomatik Plaka okuyucu kullanmak için birleştiğinde, muhabir gen taşıyan rekombinant virüsler bu deneyleri standardizasyon ve yüksek üretilen iş amaçları için daha uygun hale getirebilirsiniz.
RSV bir saran, nonsegmented olumsuz anlamda RNA Pneumoviridae aile, sipariş Mononegavirales5 Orthopneumovirus cins ait virüstür. RSV genomu yaklaşık 15 kodlamayan bölge lideri ve römork ve 11 protein kodlama 10 transkripsiyon birim adı verilen 3′ ve 5′ ekstremitelerde, içeren KB, tek iplikçikli, negatif anlamda RNA büyüktür. Genlerin aşağıdaki gibi sıralanır: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (M2-1 ve M2-2 proteinler için kodlama) ve L-5′. Genomik RNA nükleoprotein N. kullanma encapsidated genomik RNA bir şablon olarak tarafından sıkıca paketlenmiş, viral RNA’ya bağımlı RNA polimeraz (RdRp) transkripsiyon ve çoğaltma viral RNA’ın sağlayacaktır. Viral RdRp başına nükleotit polimeraz etkinlik taşıyan büyük protein L oluşmaktadır, onun zorunlu kofaktör Fosoprotein P ve viral transkripsiyonu işlevleri M2-1 protein6faktör. Enfekte hücrelerde, RSV dahil organları (IBS) adı verilen sitoplazmik kapanımlar oluşumuna neden olmaktadır. Morfolojik benzer sitoplazmik kapanımlar birkaç Mononegavirales7,8,9,10için gözlemledim. Kuduz virüsü, vesicular Stomatit virüs (VSV), Ebola virüsü ve viral RNA sentezi böylece viral fabrikalar8,9,11, kabul edilebilir IBS içinde oluştuğunu gösterdi RSV son çalışmalar 12. virüs fabrika RNA ve viral proteinler viral RNA sentezi için gerekli konsantre ve hücresel proteinler13,14,15,16, da içeren 17. IBS sergilemek hangi konsantre IB ilişkili granül (IBAGs) denilen bir fonksiyonel subcompartment yeni synthetized yeni doğmakta olan viral mRNA M2-1 protein ile birlikte. Genomik RNA ve L, P ve N IBAGs algılanmaz. IBAGs küçük dinamik küresel sıvı organelleri12özelliklerini sergileyen IBS içinde yapılardır. Merkezi rolü IBS rağmen viral çarpma, doğa, iç yapısı, oluşumu ve viral Bu fabrikaların işleyişi hakkında çok az bilinir.
İfade bir cDNA sayfasından poliovirus genomunun 198118ilk bulaşıcı viral klon üretimini etkin. Tek iplikçikli negatif RNA virüsleri, 1994’e kadar plazmid transfection hücreleri19 takip ilk bir kuduz virüsü üretimi gerçekleşti değildi. Plazmid tabanlı ters genetik için ilk sistemi RSV 199520dakika sonra yayımlandı. Ters genetik Viroloji alanında önemli gelişmeler yol açmıştır. Viral genom içine belirli değişiklikler tanıtma imkanı çoğaltma ve RNA virüsleri patogenezinde önemli anlayışlar sağlamıştır. Bu teknoloji da büyük ölçüde aşıların geliştirilmesi hedeflenen değişiklikler dizi belirli zayıflama izin vererek kolaylaştırdı. Viral çarpma hızlı bir miktar büyük ölçüde izin genom değişiklikler antiviral tarama ve eylem onların modu çalışma geliştirilmiş.
Daha önce açıklanan rağmen genetiği değiştirilmiş RSVs alma hassas kalır. Burada, iki tür rekombinant HRSV, sırasıyla RSV GFP veya RSV-M2-1-GFP ifade oluşturmak için bir protokol ayrıntılı. Bu protokol için yeni rekombinant virüsler gibi yüksek titresi, tekrarlanabilir Hollow’a için uygun ile viral stokları elde etmek için onların amplifikasyon kurtarmak için gerekli transfection koşulları tanımlamak. Ters genetik vektörel çizimler inşaat başına burada açıklanmıyor. En uygun hasat ve viral stokları dondurulması için yöntemleri açıklanmaktadır. Viral enfeksiyon parçacıklar ölçmek için en doğru yöntemi plak tahlil kalır. Hücreleri analiz süspansiyon seri dilutions ile enfekte ve süpernatant ücretsiz viral parçacıkların Difüzyon yasaklayan bir bindirme ile inkübe. Bu şartlar altında virüs sadece ilk her bulaşıcı parçacık için bir “plak” oluşturan bitişik hücreleri enfekte edecek. Geleneksel RSV titrasyon assay olarak, plaklar immunostaining tarafından ortaya ve mikroskobik gözlem altında sayılır. Bu yöntem pahalı ve zaman alıcı. Burada çok basit bir protokol plaklar çıplak gözle görünür oluşumu sağlar Mikrokristalin selüloz bindirme kullanılarak RSV plak tahlil için açıklanan. RSV GFP ölçü RSV çoğaltma ve böylece, için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir antiviral ilaçlar etkisini ölçmek. Ters genetik ve canlı görüntüleme teknolojisi birleştiren, biz nasıl bilim adamları IBS gibi viral hücre içi yapılar dinamikleri takip etmek ve M2-1 canlı hücrelerdeki görselleştirmek için RSV-M2-1-GFP sağlar göstermek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada rekombinant RSVs beş plazmid gelen kurtarma yöntemi ve onların amplifikasyon mevcut. Virüs genomu işleme yeteneği mutasyon test etmek ve ek bir gen veya etiketli bir viral protein hızlı Viroloji araştırma devrim yarattı. RSV biz açıklanan ve bu makaledeki örnek bir muhabir gen, RSV-GFP (yayınlanmamış) ve bir M2-1 protein bir GFP etiketi12‘ ye erimiş ifade ifade bir virüs olduğu gibi kullanılabilir. RSV kurtarmak zordur ve pratik gerektirir. Transfection verimlilik, tran…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr Qin Yu AstraZeneca R & D Boston, MA, ABD AZD4316 uyuşturucu verdiğiniz için teşekkür ederiz. Yazarlar Cymages platforma erişim ScanR Olympus mikroskop için minnettarız tarafından desteklendiği bölgesinden Ile-de-France (LOŞ bir sağlık) verir. Yazarlar INSERM ve Versailles Saint-Quentin Üniversitesi destek kabul etmiş oluyorsunuz.
Materials
| 35mm µ dish for live cell imaging | Ibidi | 81156 | |
| A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent. |
| BSRT7/5 | not commercially available | See ref 22. Buchholz et al, 1999 | |
| Crystal violet solution | Sigma | HT90132 | |
| Fluorescence microscope for observations | Olympus | IX73 Olympus microscope | |
| Fluorescence microscope for videomicroscopy | Olympus | ScanR Olympus microscope | |
| HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
| HEPES ≥99.5% | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent. |
| MEM (10X), no glutamine | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
| MEM, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
| MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% | Sigma | M7506 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Plasmids | not commercially available | see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014 | |
| See Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
| Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 |
SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. |
| Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 |
SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
| Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus custom siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
| SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
| SiRNA transfection reagent | Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent. |
| Sodium Bicarbonate 7.5% solution | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Spectrofluorometer | Tecan | Tecan infinite M200PRO |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
- DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
- DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
- Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
- Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
- Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).
- Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
- Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
- Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
- Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).
- Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
- Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
- Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
- Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
- Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
- Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
- Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
- Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5′ proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
- Rameix-Welti, M. -. A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104 (2014).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
- Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
- Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
- McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus – direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
- Novina, C. D., Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).
- Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5′-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
- Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
- Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
- Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
- Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
- DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
- Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).
