Generación, amplificación y titulación de virus sincitiales respiratorios recombinantes

RSV humano es la principal causa de hospitalización por infección respiratoria aguda en niños en todo el mundo¹. Además, RSV se asocia con una sustancial morbilidad en adultos comparables a la gripe, con la mayor parte de la hospitalización y la carga de mortalidad en los ancianos². No hay vacunas o antivirales específicos disponibles sin embargo contra el VRS, pero promete nuevos fármacos están en desarrollo^3,4. La complejidad y la pesadez de las técnicas de cuantificación de la multiplicación de RSV impiden la búsqueda de antivirales o vacunas a pesar de esfuerzos considerables. La cuantificación de la multiplicación de RSV in vitro se basa generalmente en métodos laboriosos, lentos y costosos, que consisten sobre todo en el análisis del efecto citopático por microscopia, immunostaining, reducción de placa ensayos cuantitativos (qRT) de la transcriptasa reversa-reacción en cadena de polimerasa (PCR) y enzima-ligado del inmunosorbente pruebas de ensayo. Virus con genomas modificados y la expresión de genes reporteros, tales como codificación de la GFP, son más convenientes para tales proyecciones. Junto a la utilización de lectores de placa automatizada, virus recombinantes portadores de gen reportero pueden hacer estos ensayos más conveniente para los propósitos de estandarización y alto rendimiento.

RSV es un virus ARN de sentido negativo envuelto, que pertenece al género Orthopneumovirus de Pneumoviridae familiar, orden Mononegavirales⁵. El genoma del RSV es un ARN monocatenario, de sentido negativo de unos 15 kb, que contiene una región noncoding en el extremos 3′ y 5′ llamado líder y Trailer y 10 unidades transcripcionales que codifican 11 proteínas. Los genes se ordenan como sigue: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codificación de las proteínas de 1 M2 y M2-2) y L-5′. El ARN genómico firmemente empaquetado por la nucleoproteína N. usando el genoma de ARN genómico como plantilla, viral RNA polimerasa dependiente de ARN (RdRp) se asegurará de transcripción y replicación del ARN viral. RdRp viral se compone de la proteína grande L que lleva la actividad de polimerasa nucleótidos por sí, su cofactor obligatorio la fosfoproteína P y la proteína M2-1 que funciona como una transcripción viral factor⁶. En las células infectadas, RSV induce la formación de inclusiones citoplasmáticas llamadas cuerpos de inclusión (IBs). Inclusiones citoplásmicas morfológicamente similares se han observado varios Mononegavirales^7,8,9,10. Recientes estudios sobre el virus de la rabia, virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus de Ebola y RSV demostrada que la síntesis de RNA viral ocurre en IBs, que pueden considerarse así como fábricas virales^{8,9,11, 12}. las fábricas de virus concentrado el ARN y las proteínas virales necesarias para la síntesis de RNA viral y también contienen proteínas celulares^{13,14,15,16, 17}. IBs exhiben un subcompartment funcional llamado gránulos asociada a IB (IBAGs), que se concentran los recién sintetizado naciente mRNA viral junto con la proteína M2-1. El RNA genómico y la L, P y N no son detectados en IBAGs. IBAGs son pequeñas estructuras esféricas dinámicas dentro de IBs que exhiben las propiedades de organelos líquido¹². A pesar del papel central del SCI en la multiplicación viral, muy poco se sabe acerca de la naturaleza, estructura, formación y funcionamiento de estas fábricas virales.

La expresión del genoma de un virus de la polio de un cDNA permitieron la producción de la primera copia viral infecciosa en 1981¹⁸. Para negativo virus de ARN monocatenario, no fue hasta 1994 que la producción de un primer virus de la rabia después de la transfección de plásmidos en células¹⁹ ocurrió. El primer plásmido sistema basado en inversa genético para RSV fue publicado en 1995²⁰. Genética reversa ha conducido a importantes avances en el campo de la virología. La posibilidad de introducir modificaciones específicas en el genoma viral ha proporcionado penetraciones críticas en la replicación y patogenia del virus del RNA. Esta tecnología también ha facilitado el desarrollo de vacunas por lo que permite la atenuación específica a través de una serie específica de modificaciones. Modificaciones del genoma que permite una cuantificación rápida de la multiplicación viral grandemente mejoraron del antiviral proyección y estudio de su modo de acción.

Aunque descrito previamente, obtención de transgénicos RSVs sigue siendo delicado. Aquí detallamos un protocolo para crear dos tipos de HRSV recombinante, respectivamente expresan GFP RSV o RSV-M2-1-GFP. En este protocolo, describimos las condiciones de la transfección a rescatar los nuevos virus recombinantes, así como su amplificación para obtener poblaciones virales con alto título, apto para experimentaciones reproducibles. La construcción de vectores de la genética reversa propiamente se describe aquí. Describir métodos de cosecha óptima y la congelación de las poblaciones virales. El método más preciso para cuantificar partículas infecciosas virales sigue siendo el ensayo de placa. Las células son infectadas con diluciones seriadas de la suspensión analizada y se incubaron con un recubrimiento que impide la difusión de partículas virales libres en el sobrenadante. En esas condiciones, el virus infectará sólo celdas contiguas formando una “placa” para cada partícula infecciosa inicial. En el análisis convencional de la titulación de RSV, placas son reveladas por inmunotinción y contadas bajo observación microscópica. Este método es costoso y desperdiciador de tiempo. Aquí describimos un protocolo muy simple para un ensayo de placa de RSV mediante recubrimiento de celulosa microcristalina que permite la formación de placas visibles al ojo desnudo. Mostramos cómo se puede utilizar RSV-GFP a medida RSV replicación y, por tanto, para cuantificar el impacto de antivirales. Combinación de genética reversa y en tecnología de imagen, demostramos cómo RSV-M2-1-GFP permite a los científicos visualizar M2-1 en células vivas y seguir la dinámica de estructuras virales intracelulares, como IBs.