Поколение, усилители и титрование рекомбинантных респираторных вирусов-синцитиальный

RSV человека является основной причиной госпитализации для острой инфекции дыхательных путей в младенцев во всем мире¹. Кроме того RSV ассоциируется с существенной заболеваемости в сопоставимых с гриппом, с большинством госпитализации и бременем смертности в пожилых²взрослых. Не существует вакцины или конкретных противовирусные препараты доступны еще против RSV, но перспективных новых препаратов находятся в развития^3,4. Сложности и тяжести методы количественной оценки RSV умножения затрудняют поиск противовирусные препараты и вакцины, несмотря на значительные усилия, прилагаемые. Количественная оценка RSV умножения в пробирке обычно основана на трудоемкий, длительным и дорогостоящим методы, которые состоят главным образом в анализе цитопатического эффекта микроскопии, иммуноокрашивания, сокращение зубного налета анализов, количественные обратной транскриптазы (qRT)-полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа тестов. Вирусы с модифицированных геномов и выражая репортер генов, например кодирования для GFP, являются более подходящими для таких фильмов. В сочетании с использованием автоматизированных пластины читателей, Репортер ген нося рекомбинантных вирусы могут сделать эти анализы больше подходит для целей стандартизации и высок объём.

RSV является запечатанным, палочкоядерных отрицательный смысл РНК вирус, который принадлежит к роду Orthopneumovirus из Mononegaviralesсемьи, порядок Pneumoviridae ,⁵. Геном RSV является одной strand, отрицательные чувство РНК около 15 КБ, который содержит некодирующей региона на 3 и 5′ конечностей, назвал лидера и трейлер и 10 transcriptional единиц кодирования 11 белков. Гены упорядочиваются следующим: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, м2 (кодировка для белков м2-1 и м2-2) и L-5′. Геномной РНК плотно упакованы, Нуклеопротеиды N. Using encapsidated геномной РНК как шаблон, вирусной РНК зависимой РНК-полимеразы (RdRp) обеспечит транскрипцию и репликацию вирусной РНК. Вирусных RdRp состоит из большой белка L, который осуществляет действие полимеразы нуклеотида таковой, ее обязательной кофактор фосфоропротеид P и м2-1 белок, который функционирует как вирусный транскрипции фактор⁶. В инфицированных клетках RSV индуцирует образование цитоплазматических включений, называется включением органов (IBs). Морфологически похожие цитоплазматических включений было отмечено несколько Mononegavirales^7,8,9,10. Недавние исследования на вирус бешенства, вирус везикулярного стоматита (ВСВ), вирус Эбола и RSV, показал, что синтез вирусной РНК происходит в IBs, которые таким образом могут рассматриваться как вирусные фабрики^{8,9,11, 12}. вирус фабрики сконцентрировать РНК и вирусные белки, необходимые для синтеза вирусной РНК и также содержат клеточных белков^{13,14,,1516, 17}. IBs выставлять функциональный subcompartment, называется IB-связанные гранулы (IBAGs), которые концентрируют вновь синтезированный зарождающейся вирусный мРНК вместе с белком м2-1. Геномной РНК и L, P и N не обнаруживаются в IBAGs. IBAGs являются небольшие динамические сферических структуры внутри IBs, которые демонстрируют свойства жидкого органеллы¹². Несмотря на центральную роль IBs в Вирусный умножения очень мало известно о природе, внутренняя структура, формирования и функционирования этих вирусные фабрики.

Выражение геном полиовируса из cDNA включено производство первых инфекционные вирусные клон в 1981 году¹⁸. Для отрицательных в одноцепочечной РНК-вирусов было не до 1994 года производство первого вируса бешенства, после трансфекции плазмид в клетки¹⁹ имели место. Первый на основе плазмида обратный генетической системы для RSV был опубликован в 1995 году²⁰. Обратный генетики привели к крупным достижениям в области вирусологии. Возможность внесения конкретных изменений в вирусного генома предоставил критических идеи на репликации и патогенеза РНК-вирусов. Эта технология также значительно облегчило разработку вакцин, позволяя конкретных затухания через целевые серии модификаций. Изменения генома, позволяя быстрое количественного определения вирусных умножения значительно улучшена антивирусной проверки и изучения режима их действий.

Хотя ранее описанных, получение генетически модифицированных RSVs остается нестабильным. Здесь мы подробно протокол для создания двух типов рекомбинантных HRSV, соответственно, выражая RSV-GFP или RSV-м2-1-GFP. В этом протоколе мы описываем трансфекции условия, необходимые для спасения рекомбинантных новых вирусов, а также их усиления для получения вирусных запасов с высокий титр, подходит для воспроизводимых экспериментах. Строительство векторов обратной генетики per se не описано здесь. Мы описывают методы для оптимального сбора урожая и замораживание вирусных запасов. Наиболее точным методом для количественного определения вирусных инфекционных частиц остается assay металлической пластинкы. Клетки инфицированные серийных разведений анализируемого подвески и инкубировали с накладкой, который запрещает распространение свободных вирусных частиц в надосадке. В таких условиях вирус будет только заразить смежных ячеек, образуя «налет» для каждой первоначальной инфекционные частицы. В обычных assay титрования RSV бляшками выявлены, иммуноокрашивания и учитываются в микроскопические наблюдения. Этот метод является дорогостоящим и трудоемким. Здесь мы описали очень простой протокол для assay металлической пластинкы RSV, используя микрокристаллическая оверлея, который позволяет образованию бляшек, видимых невооруженным глазом. Мы покажем, как RSV-GFP может использоваться мера RSV репликации и, таким образом, для количественной оценки воздействия противовирусных препаратов. Сочетание обратной генетики и живой технологии визуализации, мы демонстрируем, как RSV-м2-1-GFP позволяет ученым визуализировать м2-1 в живых клеток и следовать за динамику внутриклеточная вирусная структур, таких как IBs.