Geração, amplificação e titulação do vírus sincicial respiratórios recombinantes

RSV humana é a principal causa de hospitalização por infecção aguda do trato respiratório em crianças em todo o mundo¹. Além disso, a RSV é associado com um fardo de doença substancial em adultos comparáveis à gripe, com a maioria da hospitalização e carga de mortalidade no idoso². Não existem vacinas ou específicas antivirais disponíveis ainda contra RSV, mas prometendo novas drogas estão em desenvolvimento^3,4. A complexidade e o peso das técnicas de quantificação de multiplicação RSV impedem a busca de antivirais ou vacinas, apesar dos esforços consideráveis atuais. A quantificação de multiplicação RSV in vitro geralmente é baseada em métodos trabalhosos, demorados e caros, que consistem principalmente na análise do efeito citopático por microscopia, imunocoloração, redução de placa bacteriana, ensaios, quantitativos transcriptase reversa (qRT)-reação em cadeia da polimerase (PCR) e testes de ensaio enzima-lig da imunoabsorção. Vírus com genomas modificadas e expressar genes repórter, tais como aqueles que codifica para o GFP, são mais adequados para tais projeções. Juntamente com a utilização de leitores de placa automatizado, vírus recombinantes gene portadores de repórter podem fazer estes ensaios mais adequados para fins de padronização e alta produtividade.

RSV é um vírus de RNA sentido negativo envelopado, conjuntos que pertence ao gênero Orthopneumovirus do Pneumoviridae familiar, ordem Mononegavirales⁵. O genoma da RSV é um single-strand, negativo-sentido RNA de cerca de 15 kb, que contém uma região não-codificante as extremidades 3′ e 5′ chamado Leader e Trailer e 10 unidades transcricionais codificação 11 proteínas. Os genes estão ordenados da seguinte forma: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codificação para proteínas M2-1 e M2-2) e L-5′. O RNA genômico é firmemente embalado pela cadeia s. Using o RNA genômico encapsidated como um modelo, viral RNA-dependente do RNA polimerase (RdRp) garantirá a transcrição e replicação do RNA viral. RdRp viral é composto da proteína grande L que exerce a atividade de polimerase nucleotídeo por si, seu cofator obrigatório o phosphoprotein P e a proteína M2-1, que funciona como uma transcrição viral fator⁶. Em células infectadas, RSV induz a formação de inclusões citoplasmáticas, chamado de corpos de inclusão (IBs). Inclusões citoplasmáticas morfologicamente semelhantes têm sido observadas por várias Mononegavirales^7,8,9,10. Estudos recentes sobre o vírus da raiva, vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus Ebola e RSV mostrou que a síntese de RNA viral ocorre na IBs, que assim podem ser consideradas como fábricas viral^{8,9,11, 12}. as fábricas de vírus concentrar o RNA e as proteínas virais necessárias para a síntese de RNA viral e também contêm proteínas celulares^{13,14,15,16, 17}. SII exibem um subcompartment funcional chamado grânulos de IB-associado (IBAGs), que concentram o recém synthetized nascente mRNA viral juntamente com a proteína M2-1. O genoma RNA e a L, P e N não são detectadas em IBAGs. IBAGs são pequenas estruturas esféricas dinâmicas dentro IBs que exibem as propriedades do líquido organelas¹². Apesar do papel central da IBs na multiplicação viral, muito pouco é conhecido sobre a natureza, estrutura interna, formação e operação destas fábricas viral.

A expressão do genoma de um vírus de um cDNA permitiu a produção do primeiro clone infeccioso viral em 1981¹⁸. Para single-stranded vírus de RNA negativos, não foi até 1994 que a produção de um vírus de raiva primeira seguindo transfection de plasmídeos em células¹⁹ teve lugar. O primeiro baseado em plasmídeo reverso sistema genético para RSV foi publicado em 1995,²⁰. Genética reversa têm levado a grandes avanços no campo da virologia. A possibilidade de introduzir modificações específicas no genoma viral forneceu insights críticos sobre a replicação e a patogênese dos vírus de RNA. Esta tecnologia também muito tem facilitado o desenvolvimento de vacinas permitindo atenuação específica através de uma série específica de modificações. Modificações de genoma, permitindo uma rápida quantificação de multiplicação viral grandemente melhoraram a triagem antiviral e estudo do seu modo de ação.

Embora anteriormente descrito, obter RSVs geneticamente modificados continua a ser delicado. Aqui, detalhamos um protocolo para criar dois tipos de HRSV recombinante, respectivamente, expressando RSV-GFP ou RSV-M2-1-GFP. Neste protocolo, descrevemos as condições de transfeccao necessárias para resgatar os novos vírus recombinantes, bem como sua amplificação para obter ações virais com título elevado, apropriado para experimentações reprodutíveis. A construção de vetores a genética reversa por si não está descrita aqui. Descrevemos os métodos de colheita ideal e congelamento de estoques virais. O método mais preciso para quantificar as partículas virais infecciosas permanece o ensaio da chapa. Células são infectadas com diluições em série da suspensão analisada e incubadas com uma sobreposição que proíbe a difusão de partículas virais livres no sobrenadante. Em tais condições, o vírus só irá infectar células contíguas, formando uma “placa” para cada partícula infecciosa inicial. No ensaio de titulação convencional de RSV, placas são reveladas por imunocoloração e contadas sob observação microscópica. Este método é caro e demorado. Aqui descrevemos um protocolo muito simples para um ensaio de placa RSV usando sobreposição de celulose microcristalina que permite a formação de placas visíveis a olho nu. Mostramos como RSV-GFP pode ser usado para replicação de RSV medida e, assim, para quantificar o impacto de antivirais. Combinação genética reversa e tecnologia de imagem ao vivo, demonstramos como RSV-M2-1-GFP permite aos cientistas para visualizar M2-1 em células vivas e a seguir a dinâmica das estruturas virais intracelulares, tais como IBs.