Generazione, amplificazione e titolazione del virus sinciziale respiratorio ricombinante

RSV umana è la principale causa di ricovero in ospedale per infezione acuta delle vie respiratorie nei neonati nel mondo¹. Inoltre, RSV è associato a un onere notevole malattia negli adulti paragonabili all’influenza, con la maggior parte dell’ospedalizzazione e l’onere di mortalità in anziani². Non esistono vaccini o farmaci antivirali specifici disponibili ancora contro RSV, ma promettendo nuovi farmaci sono in sviluppo^3,4. La complessità e la pesantezza delle tecniche di quantificazione di moltiplicazione RSV ostacolare la ricerca di antivirali o vaccini nonostante i notevoli sforzi attuali. La quantificazione della moltiplicazione di RSV in vitro è generalmente basata su metodi laboriosi, lunghi e costosi, che consistono principalmente nell’analisi dell’effetto citopatico da microscopia, immunostaining, riduzione della placca saggi, quantitative trascrittasi inversa (qRT)-reazione a catena della polimerasi (PCR) ed enzima-collegata dell’immunosorbente test di analisi. Virus con genomi modificati e che esprimono i geni reporter, come quelli codificanti per la GFP, sono più adatti per tali proiezioni. Accoppiato all’uso di lettori di micropiastre automatizzati, virus ricombinante di reporter gene-trasportare può rendere queste analisi più adatta per scopi di alto-rendimento e standardizzazione.

RSV è un involucro,-senso virus a RNA che appartiene al genere di Orthopneumovirus di Pneumoviridae famiglia, ordine Mononegavirales⁵. Il genoma di RSV è un RNA single-strand, senso negativo di circa 15 kb, che contiene una regione non codificante alle estremità 3′ e 5′ chiamato Leader e Trailer e 10 unità trascrizionale codifica 11 proteine. I geni vengono ordinati come segue: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codifica per le proteine M2-1 e M2-2) e L-5′. il RNA genomico è strettamente confezionato dalla nucleoproteina N. Using il RNA genomico incapsidato come un modello, in modo virale RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp) trascrizione e replicazione del RNA virale. RdRp virale è composta da grande proteina L, che trasporta l’attività della polimerasi del nucleotide per sé, suo cofattore obbligatorio la fosfoproteina P e la proteina M2-1 che funziona come una trascrizione virale fattore⁶. Nelle cellule infette, RSV induce la formazione di inclusioni citoplasmiche chiamati corpi di inclusione (IBs). Le inclusioni citoplasmiche morfologicamente simili sono state osservate per diversi Mononegavirales^7,8,9,10. Recenti studi sul virus della rabbia, virus della stomatite vescicolare (VSV), il virus di Ebola e RSV ha mostrato che la sintesi di RNA virale si presenta in IBs, che può dunque essere considerata come fabbriche virali^{8,9,11, 12}. le fabbriche di virus concentrare il RNA e proteine virali, necessarie per la sintesi del RNA virale e contengono anche proteine cellulari^{13,14,15,16, 17}. IBs esibiscono un subcompartment funzionale chiamato granuli IB-collegato (IBAGs), che si concentrano il recentemente sintetizzato mRNA virale nascente insieme con la proteina M2-1. il RNA genomico e la L, P e N non vengono rilevati in IBAGs. IBAGs sono piccole strutture sferiche dinamici all’interno di IBs che presentano le proprietà di organelli liquido¹². Nonostante il ruolo centrale di IBs in moltiplicazione virale, pochissimo è conosciuto circa la natura, struttura interna, formazione e funzionamento di queste fabbriche virali.

L’espressione del genoma di un poliovirus da un cDNA ha permesso la produzione del primo clone virale infettiva nel 1981¹⁸. Per singolo filamento negativo virus del RNA, non era fino al 1994 che la produzione di un primo virus di rabbia dopo trasfezione di plasmidi in cellule¹⁹ ha avuto luogo. Il sistema genetico inverso basato su plasmide primo per RSV è stato pubblicato nel 1995²⁰. Genetica inversa hanno portato a grandi progressi nel campo della virologia. La possibilità di introdurre modifiche specifiche nel genoma virale ha fornito le comprensioni critiche nella replica e nella patogenesi del virus del RNA. Questa tecnologia inoltre notevolmente ha facilitato lo sviluppo di vaccini permettendo attenuazione specifici attraverso una serie mirata di modifiche. Modifiche di genoma permettendo una rapida quantificazione della moltiplicazione virale notevolmente migliorato lo screening antivirale e studio della loro modalità di azione.

Anche se descritto in precedenza, ottenendo geneticamente ad rimane delicato. Qui, dettagliamo un protocollo per creare due tipi di HRSV ricombinante, che esprimono rispettivamente RSV-GFP o RSV-M2-1-GFP. In questo protocollo, descriviamo le condizioni di transfezione necessarie per salvare i nuovi virus ricombinanti, come pure la loro amplificazione per ottenere stock virali con alto titolo, adatto per sperimentazioni riproducibile. La costruzione di vettori di genetica inversa di per sé non è descritto qui. Descriviamo i metodi per la raccolta ottimale e il blocco di stock virali. Il metodo più preciso per quantificare le particelle virali infettive rimane saggio della placca. Le cellule sono infettate con diluizioni seriali della sospensione analizzata e incubate con un overlay che vieta la diffusione di particelle virali libere nel surnatante. In tali condizioni, il virus infetterà solo celle contigue, formando una “targa” per ogni particella infettiva. Nell’analisi della titolazione RSV convenzionale, le piastre sono rivelate immunostaining e conteggiate sotto osservazione microscopica. Questo metodo è costoso e richiede tempo. Qui abbiamo descritto un protocollo molto semplice per un saggio della placca di RSV mediante sovrapposizione di cellulosa microcristallina che consente la formazione di placche visibili ad occhio nudo. Vi mostriamo come RSV-GFP può essere utilizzato per misura RSV replica e, quindi, di quantificare l’impatto di antivirali. Combinazione di genetica inversa e diretta tecnologia di imaging, dimostriamo come RSV-M2-1-GFP permette agli scienziati di visualizzare M2-1 in cellule vive e di seguire la dinamica di strutture virali intracellulari, come IBs.