Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

Menschlichen RSV ist die führende Ursache der Hospitalisierung für akute Infektion der Atemwege in Säuglinge weltweit¹. RSV ist darüber hinaus mit einer erheblichen Krankheitslast bei Erwachsenen vergleichbar mit Grippe, mit die meisten Krankenhausaufenthalt und Sterblichkeit in der ältere²Belastung verbunden. Gibt es keine Impfstoffe oder spezifische antivirale Medikamente noch gegen RSV, aber vielversprechende neue Medikamente sind in Entwicklung^3,4. Die Komplexität und die Schwere der Techniken der Quantifizierung der RSV Multiplikation erschweren die Suche nach antivirale Medikamente oder Impfstoffe trotz erheblicher Anstrengungen. Die Quantifizierung der RSV Multiplikation in-vitro-basiert im Allgemeinen auf teure, mühsame und zeitraubende Methoden bestehen vor allem in der Analyse des zytopathischen Effekts durch Plaque-Reduzierung, Mikroskopie, Immunostaining Assays, quantitative (qRT) Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Enzym-linked Immunosorbentprobe Tests zu bestimmen. Viren mit modifizierten Genomen und mit dem Ausdruck Reporter-Gene, wie die Codierung für die GFP, eignen sich eher für solche Vorführungen. Gekoppelt an die Verwendung von automatisierten Platte Leser, machen Reporter-gen tragenden rekombinante Viren diese Assays für Standardisierung und Hochdurchsatz-Zwecke besser geeignet.

RSV ist eine behüllte, nonsegmented negativen Sinne RNA-Virus, das gehört zur Gattung der Pneumoviridae Familie, Ordnung Mononegavirales⁵ Orthopneumovirus . Der RSV-Genom ist eine Single-Strang, negativen Sinn RNA von ca. 15 kb, enthält eine forensisches Region an den 3′ und 5′ Extremitäten genannt Führer und Anhänger und 10 transkriptionelle Einheiten 11 Proteine codieren. Die Gene sind wie folgt sortiert: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (M2-1 und M2-2 Proteine kodieren) und L-5 “. Die genomische RNA ist fest Nucleoprotein N. Using Encapsidated genomische RNA als Vorlage verpackt, virale RNA-abhängige RNA-Polymerase (Trichothecene) Transkription und Replikation der viralen RNA zu gewährleisten. Virale Trichothecene besteht aus der großen Protein L trägt die Nukleotid-Polymeraseaktivität schlechthin, seine obligatorische Cofaktor Phosphoprotein P und das M2-1-Protein, das Funktionen wie eine virale Transkription Faktor⁶. In infizierten Zellen induziert RSV die Bildung von zytoplasmatischen Einschlüssen Einschlusskörperchen (IBs) genannt. Morphologisch ähnliche zytoplasmatischen Einschlüssen sind für mehrere Mononegavirales^7,8,9,10beobachtet worden. Neuere Untersuchungen zu den Tollwut-Virus, vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) und Ebola-Virus RSV hat gezeigt, dass virale RNA-Synthese tritt in IBs, die somit als virale Fabriken^8,9,11, angesehen werden kann ¹². Virus Fabriken konzentrieren die RNA und virale Proteine für virale RNA-Synthese benötigt und enthalten auch zelluläre Proteine^{13,14,15,16, 17}. IBs weisen eine funktionale Subkompartiment genannt IB-assoziierten Granulat (IBAGs), die sich darauf konzentrieren die neu dazu im Entstehen begriffenen viralen mRNA zusammen mit dem M2-1-Protein. Die genomische RNA und die L, P und N werden in IBAGs nicht erkannt. IBAGs sind kleine dynamische kugelförmigen Strukturen im Inneren IBs, die die Eigenschaften des flüssigen Organellen¹²aufweisen. Trotz der zentralen Rolle von IBs in virale Vermehrung ist sehr wenig über Natur, interne Struktur, Entstehung und Betrieb dieser viralen Fabriken bekannt.

Der Ausdruck des Genoms des Poliovirus aus einer cDNA aktiviert die Produktion des ersten ansteckende virale Klons in 1981¹⁸. Für negative einzelsträngigen RNA-Viren fand es nicht bis 1994 die Produktion eines ersten Tollwut-Virus nach Transfektion von Plasmiden in Zellen¹⁹ statt. Das erste Plasmid-basierte reverse genetische System für RSV erschien 1995²⁰. Reverse Genetik führten zu großen Fortschritten auf dem Gebiet der Virologie. Die Möglichkeit der Einführung von spezifischen Änderungen in das virale Genom hat kritische Einblicke in die Replikation und Pathogenese von RNA-Viren zur Verfügung gestellt. Diese Technologie hat die Entwicklung von Impfstoffen auch erheblich erleichtert, indem es spezifische Dämpfung durch gezielte Reihe von Modifikationen erlaubt. Genom Änderungen erlauben eine schnelle Quantifizierung der viralen Vermehrung erheblich verbessert die antivirale Screening und Untersuchung von ihrer Wirkungsweise.

Obwohl zuvor beschrieben, bleibt die Erlangung genetisch veränderten RSV zart. Hier zeigen wir ein Protokoll erstelle ich zwei Arten von rekombinanten HRSV, RSV-GFP oder RSV-M2-1-GFP bzw. zum Ausdruck zu bringen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Transfektion Voraussetzungen für die neue rekombinanten Viren, sowie ihre Verstärkung zu viralen Aktien mit hoher Titer, geeignet für reproduzierbare Experimente zu retten. Der Bau der reversen Genetik Vektoren ist per se nicht beschrieben. Wir beschreiben Methoden für die optimale ernten und Einfrieren von viralen Bestände. Die genaueste Methode, infektiöse Viruspartikel zu quantifizieren bleibt Plaque-Assay. Zellen sind infiziert mit seriellen Verdünnungen der analysierten Suspension und inkubiert mit einem Overlay, das verbietet die Verbreitung von freien Viruspartikel im Überstand. Unter solchen Bedingungen wird der Virus nur zusammenhängende Zellen, aus denen eine “Tafel” für jedes erste infektiöse Partikel infizieren. In der konventionellen RSV-Titration-Assay sind Gedenktafeln von Immunostaining aufgedeckt und unter mikroskopischer Beobachtung gezählt. Diese Methode ist teuer und zeitaufwändig. Hier haben wir ein sehr einfaches Protokoll für eine RSV-Plaque-Assay mikrokristalline Cellulose verwenden, die es die Bildung von Plaques, die mit bloßem Auge sichtbar ermöglicht. Wir zeigen, wie RSV-GFP Maßnahme RSV Replikation und damit zum verwendet werden kann die Auswirkungen der antiviralen Medikamenten zu quantifizieren. Kombination von reverse Genetik und live-imaging-Technologie, zeigen wir Ihnen wie RSV-M2-1-GFP ermöglicht es Wissenschaftlern, M2-1 in lebenden Zellen zu visualisieren und die Dynamik der intrazellulären viralen Strukturen wie IBs zu folgen.