Определения скорости оплодотворение яйца Bemisia tabaci с помощью цитогенетического техника
Summary
Мы представляем простой цитогенетических техника, с помощью 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) для определения частоты оплодотворения и первичного соотношение инвазивных вредитель haplodiploid Bemisia tabaci.
Abstract
Несколько видов роста сокососущих белокрылки являются одними из наиболее разрушительных наземных вредителей во всем мире благодаря урожая ущерба, который они наносят и вирусов растений, которые они вектор. Несмотря на многочисленные исследования биологии этих видов в различных средах параметра ключа истории жизни, потомство соотношения полов, уделялось мало внимания, но имеет важное значение для прогнозирования динамики народонаселения. Основной секс отношение (соотношение полов в откладки яиц) Bemisia tabaci никогда не сообщалось, но можно найти путем определения скорости оплодотворение яйца это насекомое haplodiploid. Этот метод предполагает dechorionation яйца с отбеливателем, ряд шагов фиксации и применение общего ДНК флуоресцентные пятна, DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole, ДНК связывающих Люминесцентную краску), для привязки к мужского и женского pronuclei. Здесь мы представляем технику и пример его применения, чтобы проверить ли облигатно бактерии, риккетсии sp. nr. bellii, влияние первичной соотношение полов B. tabaci. Этот метод может помочь в демографических исследований белокрылки, или определения, если распределении секс существует с некоторых экологических раздражителей.
Introduction
Изучение распределения секс, или относительно инвестиций в мужские и женские потомство, является краеугольным камнем поведенческой экологии1,2,3. В дополнение к своей власти для тестирования адаптивные модели поведения зная стратегию распределения секс организма может улучшить модели динамики его населения. У многих видов распределение секса контролируется матерей. Чтобы определить распределение секса, важно определить основной соотношение полов или доля женщин в то время яйцо осаждения. Хотя соотношение полов в взрослых с появлением могут предоставлять ключи для секса выделения, дифференциального развития смертности между мужской и женской несовершеннолетних часто может наклонить взрослых соотношение полов существенно. В некоторых видов перепончатокрылых, порядок насекомых, содержащий муравьи, пчелы и осы, основной соотношение полов было определено с цитогенетических анализов, окрашивание эмбрионов для просмотра генетическим ДНК. Потому что перепончатокрылых haplodiploid, зарождающегося мужской яйцо гаплоидным и содержит только женского пронуклеусами (n), а зарождающегося женского яйца диплоидных и содержат как мужчин, так и женский pronuclei (2n). Хотя Aleyrodidae, sap питание семьи клопы (полужесткокрылые) известен как белокрылки, также являются haplodiploid, не было установленной assay найти основной соотношение полов в этих насекомых. Это может быть удивительно, учитывая интенсивность изучения нескольких космополитичный серьезных вредителей в этой семье и важное значение соотношения полов в конкурентных взаимодействий белокрылки4,5,6,7 ,8,9,10 и в динамике народонаселения в целом. В haplodiploid насекомых, соотношения полов непринужденно секс определение систем, позволяя возможность селективного оплодотворение и лабильных соотношения полов, которые зависят от окружающей среды2. Здесь мы представляем технику, чтобы определить основной секс соотношение видов комплекса белокрылки, вместе известные как sweetpotato белокрылки, B. tabaci. Это один из видов имя охватывает более чем 28 видов во всем мире11и включает в себя некоторые из наиболее разрушительных глобальной инвазивных вредителей12,13. Применение этого метода для определения шаблонов выделения секс в B. tabaci и другие Aleyrodidae позволит более тщательное расследование переменных, включая температуру, растения-хозяина, облигатно бактерий или завод/белокрылки патогены, которые могут повлиять белокрылки первичной соотношения полов и динамикой народонаселения белокрылки.
Мы не знают о каких-либо сопоставимых яйцо окрашивание методы B. tabaci. Протокол является удобным по сравнению с пятная методы, используемые для других насекомых яйца14 , как он опускается ночь фиксации шаг и, таким образом, может быть завершена в течение 3 ч. В качестве примера приложения, облигатно бактерии, риккетсии sp. nr. bellii, связан с женской предвзятости в нашей лаборатории линии B. tabaci Ближний Восток Азия незначительные 1 (MEAM1)15,16. В одной линии B. tabaci MEAM1 лаборатории («MAC1, «собранные от Марикопа сельскохозяйственного центра), мы проверить ли риккетсии-инфицированных женщин (R+) оплодотворить больше яиц, чем неинфицированных женщин (R–).
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол является первым, чтобы захватить оплодотворение ставки или первичной соотношение полов B. tabaci. Задача настоящего Протокола является, что она требует исследователей научиться обрабатывать белокрылки яйца быстро, обеспечить не более, чем 1 час прошло с тех пор яйца был?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось NSF Грант (DEB-1020460) для М.Ш.Х и USDA AFRI Грант (2010-03752) для М.Ш.Х Авторы благодарят Brennan зер для окрашивания белокрылки яйца с большим мастерством и Дзэн. Авторы благодарят Майка Рихль за разрешение использовать его флуоресцентный микроскоп для изображений. Авторы благодарят Сюзанн Келли и Марко Gebiola за яйца изображений. Авторы благодарят за помощь в решающие моменты в ходе экспериментов Сюзанн Келли и Джимми Конвей.
Materials
| 1XPBS | Any | ||
| 1XTBST | Any | 5X solution made from 30g Tris, 43.8g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0g NaN3 pH7.5, and brought to 1L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10X magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18mm x 18mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
References
- Charnov, E. L., May, R. M. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. , 67-92 (1982).
- Godfray, H. C. J. . Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , (1994).
- Bourke, A. F. G., Franks, N. R. . Social Evolution in Ants. , (1995).
- Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
- Liu, S. -. S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
- Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
- Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
- Sun, D. -. B., Li, J., Liu, Y. -. Q., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
- Liu, S. -. S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there?. Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
- Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
- Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
- Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
- Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
- Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
- Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
- Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
- Guo, J. -. Y., Cong, L., Wan, F. -. H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
- Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
- Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
- Qin, L., Pan, L. -. L., Liu, S. -. S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).
