קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה Cytogenetic
Summary
אנו מציגים טכניקה פשוטה cytogenetic באמצעות 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי לקבוע את שיעור ההפרייה יחס העיקרי של המזיק פולשני haplodiploid כנימת עש הטבק.
Abstract
מינים אחדים למציצת צוף כנימות עש הם חלק המזיקים יבשתי המזיק ביותר ברחבי העולם בגלל הנזק היבול שהם ממיטים ווירוסים צמח שהם וקטור. למרות מחקרים רבים של הביולוגיה של המינים הללו בסביבות שונות, פרמטר היסטוריית החיים, יחסי מין הצאצא, קיבל תשומת לב מועטה, עדיין חשוב לניבוי המלאכותיות. היחס סקס ראשי (יחס מין בבית ההטלה) של כנימת עש הטבק לא דווחה, אך ניתן למצוא על ידי קביעת שיעור הפריה הביצית של החרק haplodiploid. הטכניקה מערבת את dechorionation של ביצים עם אקונומיקה, סדרה של צעדים קיבוע של היישום של הכתם פלורסנט כללי ה-DNA, דאפי (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole, מחייב הדי הפלורסנט), כדי לאגד pronuclei נשי. כאן, אנו מציגים את הטכניקה, דוגמה של היישום שלה, כדי לבדוק אם החיידק endosymbiotic, ריקטסיה sp. ע נ. bellii, השפיע על היחס המין העיקרי של עש. שיטה זו עשויה לסייע לימודי אוכלוסיה של כנימות עש, או לקבוע אם קיימת הקצאת סקס עם גירויים סביבתיים מסוימים.
Introduction
המחקר של הקצאת סקס, או את ההשקעה היחסית בצאצאים זכר ונקבה, הוא אבן יסוד של אקולוגיה התנהגותית1,2,3. בנוסף כוחה לבדיקת דגמי התנהגות מסתגלת, לדעת את האסטרטגיה הקצאת סקס של אורגניזם עשוי לשפר את דגמי שלה המלאכותיות. במינים רבים, הקצאת מין נשלטת על ידי אמהות. כדי לקבוע מין ההקצאה, חשוב לקבוע את היחס סקס ראשי או את הפרופורציה של נקבות בזמנו של ביצה התצהיר. למרות היחס מין אצל הבוגרים עשוי לספק רמזים להקצאת סקס, דיפרנציאלי התפתחותית התמותה בין קטינים זכר ונקבה עשויים בדרך כלל להטות היחס סקס למבוגרים באופן משמעותי. במינים מסוימים של דבוראים, הסדר של חרקים המכיל נמלים, דבורים, צרעות, היחס מין העיקרי נקבע עם מבחני cytogenetic, מכתימה את העוברים כדי להציג את ה-DNA הגנטי. בגלל hymenopterans haplodiploid, ביצה זכר התחלתית הוא הפלואידי ומכיל רק את הנקבה pronucleus (n), בעוד ביצים הנשי התחלתית דיפלואידי ומכילים pronuclei גם זכר וגם נקבה (2n). למרות Aleyrodidae, משפחת האכלה sap של פשפשים (פשפשאים) המכונה כנימות עש, גם haplodiploid, לא חלה assay הוקמה כדי למצוא את יחס מין העיקרי חרקים אלה. זה אולי מפתיע בהתחשב האינטנסיביות של מחקר של כמה מזיקים רציניים הקוסמופוליטית במשפחה הזאת ואת החשיבות של יחסי מין באינטראקציות תחרותי של כנימות עש4,5,6,7 ,–8,–9,–10 ב המלאכותיות בדרך כלל. בחרקים haplodiploid גם יחסי מין הם עכבות סקס נחישות מערכות, מתן אפשרות הפריה סלקטיבית, יחסי מין יציב להשתנות עם הסביבה2. כאן אנו מציגים טכניקה כדי לקבוע את היחס המין העיקרי של המתחם מינים של כנימות עש המכונה באופן קולקטיבי כנימת עש הטבק sweetpotato, עש ב. שם זה מין אחד כוללת מינים יותר מ-28 ברחבי העולם11, כולל חלק12,הכללית מזיקים פולשנית המזיק ביותר13. היישום של טכניקה זו לקביעת מין דפוסי הקצאת עש ב ו Aleyrodidae אחרים יאפשרו חקירה קפדנית יותר של משתנים, כולל טמפרטורה, מצמח פונדקאי, endosymbiotic חיידקים או צמח/כנימת עש הטבק גורמי מחלה, שעשוי להשפיע על יחסי המין העיקרי כנימת עש הטבק, כנימת עש הטבק המלאכותיות.
. אנחנו מודעים כל טכניקות דומות מכתים ביצה עבור עש. הפרוטוקול נוח בהשוואה מכתימים שיטות אחרות ביצי חרקים14 כפי שהוא משמיט שלב קיבוע בין לילה, לפיכך, יכול להסתיים בתוך 3 שעות. דוגמה אחת של יישום, של החיידק endosymbiotic, ריקטסיה sp. ע נ. bellii, מזוהה עם הטיית נקבה שלנו שורות מעבדה עש ב 1 קטין במזרח התיכון-אסיה (MEAM1)15,16. בשורה אחת דרב עש הטבק MEAM1 מעבדה (“MAC1,” שנאספו מן המרכז החקלאי Maricopa), אנחנו נבדוק אם ריקטסיה-נקבות (R.+) נגוע להפרות יותר ביצים מאשר נקבות (R.–) נגוע.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הוא הראשון כדי ללכוד את קצב הפריה או יחס העיקרי של עש. האתגר של פרוטוקול זה הוא כי הוא דורש חוקרים ללמוד כיצד להתמודד עם הביצים כנימת עש הטבק במהירות, להבטיח כי לא יותר 1 h עבר מאז הביצים היו oviposited עד הם קבועים. במהלך הניסויים ראשוני, ביצים זה תוקנו ב 3 h או postoviposition עוד היו זקן מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי מענק של ה-NSF (דב-1020460) כדי M.S.H. מענק אפריק USDA (2010-03752) כדי M.S.H. המחברים מודים ברנן Zehr על צביעת ביצים כנימת עש הטבק עם הרבה מיומנות, זן. המחברים תודה מייק ריהלה להתרת השימוש שלו מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור הדמיה. המחברים מודים סוזן וקלי מרקו Gebiola על הדימויים ביצה. המחברים תודה סוזן קלי בג’ימי קונוואי על העזרה ברגעים מכריעים במהלך הניסויים.
Materials
| 1XPBS | Any | ||
| 1XTBST | Any | 5X solution made from 30g Tris, 43.8g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0g NaN3 pH7.5, and brought to 1L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10X magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18mm x 18mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
References
- Charnov, E. L., May, R. M. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. , 67-92 (1982).
- Godfray, H. C. J. . Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , (1994).
- Bourke, A. F. G., Franks, N. R. . Social Evolution in Ants. , (1995).
- Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
- Liu, S. -. S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
- Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
- Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
- Sun, D. -. B., Li, J., Liu, Y. -. Q., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
- Liu, S. -. S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there?. Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
- Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
- Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
- Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
- Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
- Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
- Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
- Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
- Guo, J. -. Y., Cong, L., Wan, F. -. H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
- Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
- Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
- Qin, L., Pan, L. -. L., Liu, S. -. S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).
