Summary

Bepaling van het tarief van de bevruchting ei van Bemisia tabaci met behulp van een cytogenetische techniek

Published: April 01, 2019
doi:

Summary

Wij presenteren een eenvoudige cytogenetische techniek met behulp van 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om te bepalen van het tarief van de bevruchting en primaire sex-ratio van de haplodiploid invasieve plaag Bemisia tabaci.

Abstract

Een paar soorten sap-zuigende wittevlieg zijn enkele van de meest schadelijke terrestrische plagen wereldwijd vanwege de gewas-schade die ze toebrengen en plantenvirussen die ze vector. Ondanks talrijke studies van de biologie van deze soorten in verschillende omgevingen, een belangrijke levensgeschiedenis parameter, offspring sex ratio’s, weinig aandacht heeft gekregen, maar is belangrijk voor het voorspellen van de populatiedynamiek. De primaire verhouding van de sex (sex ratio op oviposition) van Bemisia tabaci is nooit gemeld maar kan worden gevonden door de bepaling van het tarief van de bevruchting ei van dit insect van de haplodiploid. De techniek gaat de dechorionation van de eieren met bleekmiddel, een reeks fixatie stappen en de toepassing van de algemene DNA fluorescerende vlek, DAPI (4 ‘: 6-diamidino-2-phenylindole, een DNA-bindende fluorescente kleurstof), te binden aan mannelijke en vrouwelijke pronuclei. Hier presenteren we de techniek, en een voorbeeld van de toepassing ervan, om te testen of een endosymbiotic bacterie Rickettsia sp. nr. bellii, beïnvloed de primaire sex-ratio van B. tabaci. Deze methode kan helpen bij bevolkingsonderzoeken van wittevlieg, of vast te stellen of geslacht toewijzing bestaat met bepaalde milieu prikkels.

Introduction

De studie van geslacht verdeling, of de relatieve investering in mannelijke en vrouwelijke nakomelingen, is een hoeksteen van gedragsecologie1,2,3. Naast de macht voor het testen van adaptieve modellen van gedrag, kan te weten de seks toewijzing strategie van een organisme modellen voor de populatiedynamica verbeteren. In vele soorten, wordt seks toewijzing gecontroleerd door moeders. Ter vaststelling van geslacht toewijzing, is het belangrijk om te bepalen van de primaire sex-ratio of het aandeel van vrouwen op het moment van de ei-afzetting. Hoewel de sex ratio op volwassen opkomst aanknopingspunten seks toewijzing bieden kan, kan differentiële developmental sterfte tussen mannelijke en vrouwelijke exemplaren het volwassen sex-ratio aanzienlijk en algemeen scheeftrekken. In sommige soorten Hymenoptera (Vliesvleugeligen), de volgorde van insecten, mieren, bijen en wespen, met is de primaire sex-ratio vastgesteld met cytogenetische tests, kleuring van de embryo’s om weer te geven van de genetische DNA. Omdat hymenopterans haplodiploid, een beginnende mannelijke ei is haploïde en bevat alleen de vrouwelijke pronucleus (n), terwijl beginnende vrouwelijke eieren diploïde zijn en zowel mannelijke als vrouwelijke pronuclei (2n bevatten). Hoewel Aleyrodidae, de sap-voeding-familie van true bugs (Hemiptera) bekend als wittevlieg, ook haplodiploid, is er geen een gevestigde assay te vinden van de primaire sex-ratio in deze insecten. Dit is misschien verwonderlijk gezien de intensiteit van de studie van de paar kosmopolitische ernstige plagen uit deze familie en het belang van de sex ratio’s in concurrerende interacties van wittevlieg4,5,6,7 ,8,9,10 en in de populatiedynamiek in het algemeen. In haplodiploid insecten ook zijn sex ratio’s onbeperkt door geslacht bepaling systemen, waardoor de mogelijkheid van selectieve bevruchting en onstabiele sex-ratio’s die met de milieu-2 variëren. Hier presenteren we een techniek om te bepalen van de primaire sex-ratio van het complex van de soorten van wittevlieg gezamenlijk bekend als de sweetpotato wittevlieg, B. tabaci. Deze naam voor één soort omvat meer dan 28 soorten wereldwijd11en omvat enkele van de meest schadelijke global invasieve ongedierte12,13. De toepassing van deze techniek om seks patronen van geheugentoewijzingen die in B. tabaci en andere Aleyrodidae toestaat een strenger onderzoek van variabelen, met inbegrip van temperatuur, waardplant, endosymbiotic bacteriën of plant/wittevlieg ziekteverwekkers, die invloed op de wittevlieg primaire sex ratio’s en de populatiedynamiek van de wittevlieg hebben kunnen.

Wij zijn niet op de hoogte van eventuele vergelijkbare ei-kleuring technieken voor B. tabaci. Het protocol is handig in vergelijking met verkleurende methoden die worden gebruikt voor andere insecten eieren14 omdat het nalaat een overnachting fixatie stap en, dus, kan worden voltooid binnen de 3 uur. Als een voorbeeld van een toepassing, een endosymbiotic bacterie Rickettsia sp. nr. bellii, wordt geassocieerd met vrouwelijke bias in ons laboratorium lijnen B. tabaci Midden-Oosten en Azië kleine 1 (MEAM1)15,16. In één B. tabaci MEAM1 laboratorium regel (“MAC1,” verzameld vanuit het midden van de landbouw Maricopa), testen we of Rickettsia-besmette (R+) vrouwen bevruchten meer eieren dan niet-geïnfecteerde (R) vrouwtjes.

Protocol

Opmerking: Zorg ervoor dat alle werkzaamheden wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur in een goed geventileerde ruimte of in een zuurkast. Alle ‘druppels’ in dit protocol worden gedefinieerd als 5 – 20 µL, afhankelijk van de voorkeur van de exploitant. 1. eerste Setup Toestaan dat vrouwelijke wittevlieg te oviposit op schone bladeren. Voorbeelden voor oviposition arenas zijn clip kooien of bladeren gesneden te passen op agar in een petrischaal. Maak een coverable ga…

Representative Results

Om te testen of Rickettsia is van invloed op het tarief van de bevruchting van B. tabaci MEAM1 vrouwtjes, die wij gefokt Rickettsia-besmet (R+) of niet-geïnfecteerde (R-) B. tabaci op cowpea planten (Vigna unguiculata) in aparte kooien op een 16 h licht/8 h donkere fotoperiode, 27 ° C en 70% relatieve vochtigheid. R+ werden R- vierde instar wittevlieg zorgvuldig verwijderd uit bladeren en geïsoleer…

Discussion

Dit protocol is de eerste om de bevruchting tarief of primaire sex ratio van B. tabacite leggen. De uitdaging van dit protocol is dat er onderzoekers om te leren hoe te te behandelen de wittevlieg eieren snel, ervoor te zorgen dat niet meer dan 1 uur verstreken is sinds de eieren waren oviposited totdat ze zijn vastgesteld. Tijdens voorbereidende experimenten waren de eieren die waren vastgesteld op 3 uur of meer postoviposition te oud om te observeren van bevruchting, als syngamy had plaatsgevonden en mitotisch…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gefinancierd door een subsidie van NSF (DEB-1020460) te M.S.H. en een USDA AFRI-grant (2010-03752) te M.S.H. De auteurs bedanken Brennan Zehr kleuring wittevlieg eieren met veel vaardigheid en Zen. De auteurs bedanken Mike Riehle voor het toestaan van het gebruik van zijn fluorescente microscoop voor imaging. De auteurs bedanken Suzanne Kelly en Marco Gebiola voor de beelden van het ei. De auteurs bedanken Suzanne Kelly en Jimmy Conway voor het helpen op beslissende momenten tijdens de experimenten.

Materials

1XPBS Any
1XTBST Any 5X solution made from 30g Tris, 43.8g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0g NaN3 pH7.5, and brought to 1L with PCR grade water
Bleach Clorox Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite
Clear nail polish Any
DAPI dilactate Santa Cruz Biotechnology sc300415
Ethanol Any Dilute to 70% EtOH
Fluorescent microscope Nikon Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10X magnification can be used
Glacial acetic acid Mallinckrodt UN2789
Glycerol Any
Microscope Wild A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used
Microscope slide covers Any Methods are for 18mm x 18mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers.
Microscope slides Any
Minuten nadel pins BioQuip 1208SA Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips
NaCl Any
NaN3 Any
n-propyl-gallate Sigma/Santa Cruz Biotechnology P3130/sc-250794
Parafilm Bemis
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20A Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes
PCR grade water Any
Pipette tips Any Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins
Small dropper bulb Any Must fit on Pasteur pipette
Tris Any
Tween-20 Any

References

  1. Charnov, E. L., May, R. M. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. , 67-92 (1982).
  2. Godfray, H. C. J. . Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , (1994).
  3. Bourke, A. F. G., Franks, N. R. . Social Evolution in Ants. , (1995).
  4. Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
  5. Liu, S. -. S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
  6. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
  7. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
  8. Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
  9. Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
  10. Sun, D. -. B., Li, J., Liu, Y. -. Q., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
  11. Liu, S. -. S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there?. Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
  12. Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
  13. Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
  14. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  15. Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
  16. Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
  17. Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
  18. Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
  19. Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
  20. Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
  21. Guo, J. -. Y., Cong, L., Wan, F. -. H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
  22. Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
  23. Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
  24. Qin, L., Pan, L. -. L., Liu, S. -. S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).

Play Video

Cite This Article
Bondy, E. C., Hunter, M. S. Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique. J. Vis. Exp. (146), e59213, doi:10.3791/59213 (2019).

View Video