마우스에서 뇌간 에서 데이터 수집 및 분석 음성 응답 청력 측정
Summary
뇌간 은 임상 신경 생리학에서 중요한 도구입니다 반응 청력 측정을 불러 일으켰다. 요즘, 뇌간 은 약리학 및 유전 동물 모델 모두를 포함하는 기초 과학 및 전임상 연구에서도 반응 청력 측정을 불러 일으켰다. 여기에서 우리는 청각 뇌간 반응이 마우스에서 성공적으로 기록되고 분석될 수 있는 방법에 대한 상세한 설명을 제공합니다.
Abstract
뇌간 유발 반응 청력 측정 (BERA)는 임상 신경 생리학에서 중앙 관련성입니다. 시각적으로 유발된 전위(EP) 전위(EP) 또는 체감각 유발 전위(SEP)와 같은 다른 자극전위(EP) 기술이 바와 같이, 청각 유발 전위(AEP)는 동일한 자극의 반복적인 프리젠테이션에 의해 촉발됩니다. 뇌전도 (EEG) 응답은 이후에 뚜렷한 양성 (p) 및 음의 (n) 편향의 결과로 평균화됩니다. 인간에서는, 개별 피크의 진폭 그리고 대기 시간 둘 다 근본적인 신경 회로에 있는 동기화 및 전도 속도의 변경을 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 중요한 것은, AE는 또한 약리학 및 유전 동물 모형에 있는 청각 기능을 확인하고 특성화하기 위하여 기초와 전임상 과학에서 적용됩니다. 더욱이, 약리학적 인 테스트와 함께 동물 모델은 감각 신경성 난청 (예 : 연령 또는 소음 유발 청력 적자)의 치료에 잠재적 인 이점을 조사하기 위해 활용됩니다. 여기에서우리는 클릭과 톤 버스트 응용 프로그램을 사용하여 마우스에 청각 뇌간 유발 응답 (AR)을 기록하는 방법에 대한 상세하고 통합적인 설명을 제공합니다. 이 프로토콜의 특정 초점은 실험 전 동물 하우징, 마취, ABR 기록, ABR 필터링 프로세스, 자동화된 웨이블릿 기반 진폭 성장 함수 분석 및 대기 시간 감지에 있습니다.
Introduction
뇌 생리학의 핵심 측면은 학습, 기억, 정서적 반응 또는 운동 반응과 같은 다양한 본질 또는 외적 출력을 초래하는 환경 정보를 처리하는 기능입니다. 다양한 실험 및 진단 접근법은 자극 관련 뉴런 회로 내에서 개별 신경 세포 유형 또는 클러스터/뉴런의 반응성의 전기생리학적 반응을 특성화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 전기 생리학적 기술은 마이크로, 메소 및 대용량 1에 대한상이한 시공간적 치수를 다룹니다. 마이크로 스케일 레벨은 예를 들어 배양 또는 급성 해리 뉴런 1을 사용하는 다른 패치 클램프모드에서 전압 및 전류 클램프 접근법을 포함합니다. 이러한 시험관내 기술은 개별적인 현재 엔티티 및 그들의약리학적 변조2,3의특성화를 허용한다. 그러나 중요한 단점은 마이크로 및 매크로 회로 정보 통합 및 처리와 관련하여 체계적인 정보가 부족하다는 것입니다. 이 손상은 배양 된 뉴런뿐만 아니라 급성 뇌 슬라이스에서도 동시에 세포 외 다전극 기록을 허용하는 다전극 배열과 같은 메조 스케일의 생체 외 기술에 의해 부분적으로 극복됩니다4. 5.마이크로 회로는 특정 범위 (예를 들어, 해마에서)로 뇌 슬라이스에 보존 될 수 있지만, 장거리 상호 연결은 전형적으로손실6. 궁극적으로, 뉴런 회로내의 기능적 상호연결을 연구하기 위해, 거시적 척도에 대한 생체내 전기생리학적 기술이 선택된7의방법이다. 이러한 접근법은 무엇보다도, 인간 및 동물 모델 둘 다에서 수행되는 표면(경막외) 및 깊은(intracerebral) EEG 기록을 포함한다. EEG 신호는 주로 흥분제 입력8의 일반적인 우세에도 불구하고 주체에서 억제 또는 흥분될 수 있는 상이한 피질 층에서 피라미드 형 뉴런에동기화 된 시냅스 입력을 기반으로합니다. 동기화시, 세포외 전기장에서의 흥분성 세포내전위 전위-기반 이동은 표면 전극을 사용하여 두피에 기록될 수 있는 충분한 강도의 신호를 형성하기 위해 합산된다. 특히, 개별 전극에서 검출 가능한 두피 기록은 증폭기, 필터링 프로세스(로우 패스 필터, 하이 패스 필터, 노치 필터 및 특정 도체 특성을 가진 전극.
대부분의 실험 동물 종(즉, 마우스 및 래트)에서, 인간 기반 두피 EEG 접근법은 근본적인 피질에 의해 생성된 신호가 제한된 수의 동기화된피라미드 뉴런(9)으로 인해 너무 약하기 때문에 기술적으로 적용되지않는다. 10,11. 설치류에서, 표면 (두피) 전극 또는 피하 전극은 따라서 심전도에 의해 심각하게 오염되고 고품질 의 EEG 기록을불가능하게 하는 주로 전기 신경학상 유물 9,11, 12. 무마취 자유롭게 움직이는 마우스와 쥐를 사용하는 경우, 따라서 직접 감지 팁의 직접 물리적 연결을 보장하기 위해 경막 외 전극을 통해 피질또는 깊은, 내추적 구조에서 중 하나를 기록하는 것이 필수적이다 신호 생성 신경 세포 클러스터에 납 /이식 된 전극의. 이러한 EEG 접근법은 구속된 테더링 시스템 설정에서 또는 비억제 이식형 EEG 무선 원격측정 접근법 9,10,11을사용하여 수행될 수 있다. 두 기술은 자신의 장점과 단점을 가지고 있으며 발작 감수성 / 발작 활동, circadian 리듬, 수면 아키텍처, 진동 활동 및 동기화의 질적 및 정량적 특성화에 귀중한 접근 이 될 수 있습니다. 시간 주파수 분석, 소스 분석등을 포함하여 9,10,13,14,15,16,17.
테더링 된 시스템 및 무선 원격 측정은 각각 억제 / 반억제 또는 비 억제 조건하에서 EEG 기록을 허용하는 반면, 관련 실험 조건은 ABR 기록에 대한 요구 사항과 일치하지 않습니다. 라우드 스피커와 실험 동물의 정의된 위치와 제어된 음압 레벨(SPL)으로 시간이 지남에 따라 반복적으로 제시되는 정의된 음향 자극에 대한 후자의 요구. 이것은 제지 조건 하에서 머리 고정또는 마취18,19에의해 달성될 수 있습니다. 실험 적 스트레스를 줄이기 위해, 동물은 일반적으로 ABR 실험 동안 마취되지만 마취가 ABR19,20을방해 할 수 있다고 고려해야합니다.
일반적인 특성으로서, EEG는 50-100 μV. 배경 주파수 및 진폭의 전압 범위에서 상이한 주파수로 구축되어 실험 동물의 생리적 상태에 크게 의존한다. 깨어 있는 상태에서, 베타(β) 및 감마(γ) 주파수가 더 낮은 진폭을 가진 우세. 동물이 졸리거나 잠들 때, 알파(α), 세타(θ), 및 델타(δ) 주파수가 발생하여, 증가된 EEG진폭(21)을 나타낸다. 일단 감각 채널 (예를 들어, 음향 통로)가 자극되면, 정보 전파는 말초 및 중추 신경계를 통해 신경 활동을 통해 중재됩니다. 이러한 감각(예: 음향) 자극은 소위 EP 또는 유발 된 응답을 유발합니다. 특히, 이벤트 관련 전위(ERP)는 EEG(즉, 몇 마이크로볼트만)보다 진폭이 훨씬 낮다. 따라서, 단일 자극에 기초한 임의의 개별 ERP는 더 높은 진폭 의 EEG 배경에 대하여 손실될 것이다. 따라서 ERP를 기록하려면 동일한 자극(예: ABR 기록의 클릭)과 후속 평균화의 반복적인 적용이 필요하며, 이는 임의의 EEG 배경 활동 및 아티팩트를 제거한다. ABR 기록이 마취 된 동물에서 수행되는 경우, 여기에서 피하 전극을 사용하기 쉽습니다.
주로 AEP에는 일반적으로 A벌또는 BERA와 관련된 짧은 대기 시간 EP가 포함되며, 또한 중간 지연 EP(중간 지연 응답 [MLR]) 및 긴 대기 시간 EPs22와같은 이후 발병 전위가 포함됩니다. 중요한 것은, 청각 정보의 정보 처리에 있는 교란은 수시로 신경 정신병병 (demyelinating 질병, 정신 분열증 등)의 중앙 특징 및 AEP 변경과 관련되었던23,24 ,25. 행동 조사는 기능적 장애를 드러낼 수 있는 반면, AEP 연구는 특정 신경 해부학 적 구조와 관련된 청각 기능 장애의 정확한 시공간 분석을 허용합니다26.
ABR은 보통 에서 높은 강렬한 클릭 응용 프로그램에서 일반적으로 감지되며, 최대 7개의 ABR 피크(W I-WVII)가발생할 수 있습니다. 가장 중요한 파도(W I-W V)는 다음과 같은 신경 해부학 구조와 관련이 있습니다 : WI은 청각 신경 (말단 부분, 내이 내); W II를 달팽이관 핵(청각 신경의 근위 부분, 뇌간 종단); W III상수체(SOC)에 우수한 올리바리 복합체; W IV를 측면 렘니스커스(LL);; W V는 반대측에서 열등한 콜리큘러스(IC) 내의 측면 렘니스커스(LL)의 종결(27)(보충도 1)이다. WII-W V는 그(것)들에 기여하는 오름차순 청각 통로의 하나 이상의 해부학 적 구조를 가질 가능성이 있다는 것을 유의해야 한다. 특히, 피크와 청각 지역의 기본 구조의 정확한 상관 관계는 여전히 완전히 명확히되지 않습니다.
청각학에서 ABE는 스크리닝 및 진단 도구로 사용할 수 있으며 외과 모니터링28,29. 이형성증, 히pacusis 및 아나쿠스시스(예: 노화 관련 난청, 소음 유발 난청, 대사 및 선천성 난청, 기형 또는 기형으로 인한 비대칭 청력 상실 및 청력 결핍) 식별에 가장 중요합니다. 기형, 부상 및 신 생물)28. AAB는 또한 활동적이고 지적 장애가 있는 어린이 또는 기존의 청력 측정에 반응할 수 없는 다른 어린이(예: ADHD, MS, 자폐증 등)에 대한 선별 검사와 관련이 있습니다29 , 30)인공와우의 개발 및 외과적 피팅에28. 마지막으로, A브라스는 항간질제31,32와같은 신경정신병치료제의 잠재적이독성 부작용에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있다.
약리학 또는 형질전환 마우스 모델에서 인간으로 의한 신경 생리학적 지식의 번역의 가치는 쥐와 쥐33의 청각 패러다임에서 ERPs의 수준에서, 특히 수많은 설정에서 입증되었습니다. 34,35. 변경된 초기 AEP에 대한 새로운 통찰력 및 마우스와 쥐의 청각 정보 처리의 관련 변화에 대한 새로운 통찰력은 따라서 인간에게 번역될 수 있으며 청각, 신경학상 및 신경 정신 질환이 미래에. 여기에서 우리는 ABE가 기본적인 과학, 독성 학 및 약리학적 인 목적을 위해 마우스에서 성공적으로 기록되고 분석 될 수있는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 마우스에서 청각 유발 뇌간 반응을 기록하는 방법에 대한 상세하고 통합적인 설명을 제공합니다. 그것은 동물 전처리에 특정 초점을 두고, 마 취, 그리고 잠재적인 방법론 혼란 요인. 후자는 포함, 다른 사람의 사이에서, 성별, 마우스 라인, 나이, 및 주거 조건. 이러한 모든 요인은 감각신경성 난청및 청각 정보 처리의 근본적인 측면에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의해야 합니다. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 크리스티나 콜브 박사 (신경 퇴행성 질환에 대한 독일 센터 [DZNE]) 박사 로버트 스타크 (DZNE) 동물 사육 및 동물 건강 관리에 도움을 감사드립니다. 이 작품은 재정적으로 마약 및 의료 장치에 대한 연방 연구소에 의해 지원되었다 (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM, 본, 독일).
Materials
| AEP/OAE Software for RZ6 (BioSigRZ software) | Tucker-Davis Technologies (TDT) | BioSigRZ | |
| Binocular surgical magnification microscope | Zeiss Stemi 2000 | 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000 | |
| Cages (Macrolon) | Techniplast | 1264C, 1290D | |
| Carprox vet, 50mg/ml | Virbac Tierarzneimittel GmbH | PZN 11149509 | |
| Cold light source | Schott KL2500 LCD | 9.705 202 | |
| Cotton tip applicators (sterile) | Carl Roth | EH12.1 | |
| Custom made meshed metal Faraday cage (stainless steel, 2 mm thickness, 1 cm mesh size) | custom made | custom made | |
| 5% Dexpanthenole (Bepanthen eye and nose creme) | Bayer Vital GmbH | PZN: 01578681 | |
| Disposable Subdermal stainless steel Needle electrodes, 27GA, 12mm |
Rochester Electro-Medical, Inc. | S03366-18 | |
| Surgical drape sheets (sterile) | Hartmann | PZN 0366787 | |
| Ethanol, 70% | Carl Roth | 9065.5 | |
| 1/4'' Free Field Measure Calibration Mic Kit | Tucker-Davis Technologies (TDT) | PCB-378C0 | |
| Gloves (sterile) | Unigloves | 1570 | |
| Graefe Forceps-curved, serrated | FST | 11052-10 | |
| GraphPad Prism 6 Software, V6.07 | GraphPad Prism Software, Inc. | https://www.graphpad.com/ | |
| Heat-based surgical instrument sterilizer | FST | 18000-50 | |
| Homeothermic heating blanked |
ThermoLux | 461265 / -67 | |
| Ketanest S (Ketamine), 25mg/ml | Pfizer | PZN 08707288 | |
| Ringer’s solution (sterile) | B.Braun | PZN 01471434 | |
| Matlab software | MathWorks, Inc. | https://de.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Medusa 4-Channel Low Imped. Headstage | Tucker-Davis Technologies (TDT) | RA4LI | |
| Medusa 4-Channel Pre-Amp/Digitizer | Tucker-Davis Technologies (TDT) | RA4PA | |
| Microphone | PCB Pieztronics | 378C01 | |
| Multi Field Speaker- Stereo | Tucker-Davis Technologies (TDT) | MF1-S | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3012 | |
| Optical PC1 express card for Optibit Interface) | Tucker-Davis Systems (TDT) | PO5e | |
| Askina Braucel pads (cellulose absorbet pads) | B.Braun | PZN 8473637 | |
| Preamplifier | PCB Pieztronics | 480C02 | |
| RZ6 Multi I/O Processor system (BioSigRZ) | Tucker-Davis Technologies (TDT) | RZ6-A-PI | |
| 0.9% saline (NaCl, sterile) | B.Braun | PZN:8609255 | |
| SigGenRZ software | Tucker-Davis Technologies (TDT) | https://www.tdt.com/ | |
| Software R (version 3.2.1) + Reshape 2 (Version 1.4.1) + ggplot 2 (version 1.0.1) + datatable (version 1.9.4), + gdata (version 2.13.3), + pastecs (version 1.3.18), + waveslim (version 1.7.5), + MassSpecWavelet (version 1.30.0) | The R Foundation, R Core Team 2015 | Open Source Software (freely distributable) | |
| Sound attenuating cubicle | Med Associates Inc. | ENV-018V | |
| Standard Pattern Forceps, 12cm and 14.5 cm length | FST | 11000-12, 11000-14 | |
| Leukosilk tape | BSN medical GmbH & Co. KG | PZN 00397109 | |
| Tissue Forceps- 1×2 Teeth 12 cm | FST | 11021-12 | |
| Uniprotect ventilated cabinet | Bioscape | THF3378 | |
| Ventilated cabinet | Tecniplast | 9AV125P | |
| Xylazine (Rompun), 2% | Bayer Vital GmbH | PZN 1320422 |
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