Summary

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

Published: February 11, 2019
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Summary

強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーニング興味の人間 DNA 領域にバインドできる転写因子 (TFs) を識別するためにプロトコルを紹介します。このメソッドのバインディングを問い合わせたりすることができます高速スクリーニング パイプラインを使用して > 単一の実験で 1,000 TFs。

Abstract

各人間の遺伝子を調節する転写因子 (TFs) のセットを識別するは、多数の実験と計算のアプローチの統合を必要とする困難な作業です。このような 1 つの方法は、酵母 1 ハイブリッド (Y1H) 試金、TFs と DNA の相互作用の領域、レポーター遺伝子を用いた酵母核の環境でテストします。Y1H アッセイを含む 2 つのコンポーネント: ‘DNA-餌’ (例えば.、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー等) と ‘ TF-犠牲、’ レポーター遺伝子の活性化のため上映することができます。Y1H 画面を実行する最も公開されたプロトコルは DNA 餌酵母に TF 獲物ライブラリまたは配列の変換に基づいています。ここでは、パイプラインについて述べる、強化された Y1H と呼ばれる (eY1H) 試金、TF 獲物系統高密度配列を使用して配列コレクションを持つ DNA 餌株を交配による TF DNA の相互作用を尋問するところ、1,536 のスクリーニングができる (HDA) ロボットプラット フォームコロニーの形式です。これにより、スループットが劇的に増加 (60 DNA 餌系列 > 1,000 TFs 研究員あたり 2 週間はかかる) と再現性。画面とそれらの解決方法の中に発生する問題の例と同様、1,086 人間 TFs の配列に対してヒトプロモーター配列をテストすることによって期待される結果の種類を示しています。

Introduction

バイオメディカル分野で中心的な問題は、各人間の遺伝子を調整するメカニズムを決定します。転写は遺伝子発現を制御する最初のステップと対象の各遺伝子は、転写因子 (TFs) の規制を受けます。人間はエンコードのことを考える > 1,500 TFs12、各遺伝子の発現を制御する TFs の完全なセットを識別する開かれた挑戦に残る。

TF DNA の相互作用をマップする 2 種類の方法を使用できます: TF 中心と DNA の方法3 (図 1 a)。TF を中心とした方法でまたは DNA 結合特異性を決定するゲノム DNA 領域にバインドするための関心の TF がプローブされます。これらのメソッドには、クロマチン免疫沈降 (チップ) 続いて高スループット シーケンス、タンパク質結合マイクロ アレイと SELEX4,5,6が含まれます。DNA を中心とした方法では、DNA 配列に結合する TFs のセットを決定する興味の DNA シーケンスがプローブされます。このようなメソッドの中で最も広く応用イースト 1 ハイブリッド (Y1H) 試金、TFs と DNA の相互作用の地域、レポーター遺伝子7,8,9を使用して酵母核の環境でテスト済みです。

Y1H アッセイを含む 2 つのコンポーネント: ‘DNA-餌’ (例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー等) と ‘ TF-犠牲、’ レポーター遺伝子活性化9,10 (図 1 b) を上映することができます。DNA の餌は上流のクローン作成 2 つのレポーターの遺伝子 (LacZおよびHIS3) および両方の DNA bait::reporter 構造、chromatinized ‘DNA 餌系統 ‘ を生成する酵母ゲノムに統合されて。TF DNA の相互作用のために採取する DNA 餌ひずみに TF 獲物、Gal4 TF、酵母の活性化ドメイン (AD) 融合した TF を表現するプラスミッドで符号化を導入します。TF 獲物は餌 DNA シーケンスにバインドされた場合 TF 獲物で存在の広告は、この両方のレポーターの遺伝子の活性化に します。その結果、肯定的な相互作用を持つ細胞をプレート 3-アミノ-1,2,4-トリアゾール (3 AT)、競争の阻害剤を克服し同様、ヒスチジンに欠けている成長のための選択および X gal の存在下で青いコロニーとして視覚化できます。強力な酵母 Gal4 AD を使用すると、Y1H のアッセイは、リプレッサーと同様に、転写活性化因子の相互作用を検出できます。さらに、TF-犠牲が強い酵母プロモーター (ADH1) から出されることを考えるは、TFs 低内因性発現レベルが、チップ11,12の検出に挑戦しているのも相互作用を検出できます。

Y1H アッセイを行うため最も公開プロトコル選択、ピッキング、コロニーおよび相互作用の TF を識別するために配列することによって続いてプールの TF 獲物ライブラリを変換することによって酵母 DNA 餌に TF-犠牲を導入することに基づいています。個々 の変換8,9のクローンを作成します。これらは、時間のかかるプロトコル、研究員あたりテストすることができます DNA シーケンスの数を制限することです。呼ばれる、Y1H のアッセイの最近の改善強化 Y1H (eY1H) が DNA 餌酵母酵母のコレクションにそれぞれ異なる表現をチームメイトに高密度配列 (HDA の) ロボット プラットフォームを用いたスクリーニングのスループットを大幅に増加TF 獲物10,13 (図 1)。これらの画面は、唯一の 3 つのプレートを使用して 4 連で最も人間 TFs をテストするを許可する 1,536 コロニー形式を採用しています。さらに、TF DNA の相互作用は一対にテスト、ことを考えるこのアプローチ (2 つの非翻訳一塩変形) など DNA 餌とは別の TFs の間の相互作用を比較することができますまたは TF バリエーション11,12。 ,14

EY1H の試金を使用して、最大の人間と DNA を中心とした TF DNA 相互作用ネットワークに日の線虫を線引きが。特に、246 人間発生エンハンサーと 283 の TFs122,230 相互作用を同定しました。さらに、109 単一のヌクレオチド非コード バリエーション発達奇形、がん、神経疾患などの遺伝病に関連付けられている変更した TF バインディングを明らかにする eY1H のアッセイを採用しました。もっと最近、2,576 c. の elegans遺伝子プロモーターと 366 の TFs1121,714 相互作用で構成されるネットワークを記述する eY1H を使用しました。このネットワークはc. の elegans TFs の数十の機能的役割を明らかにするため尽力しました。

DNA の餌の汚れを生成、バック グラウンド レポーターの活動のレベルを評価するプロトコルがされている15,16,17は別途報告します。ここでは、1,086 人間 TFs の配列に対して任意の人間ゲノム DNA の領域を画面に使用することができます eY1H パイプラインについて述べる。一度酵母 DNA 餌ひずみが生成され、対応するプレートの上に TF 獲物配列を発見、プロトコル全体は 2 週間 (表 1) で実行できます。もっと重要なは、単一の研究者は同時に 60 餌 DNA シーケンスを選別できるようにプロトコルを並列化できます。プロトコルを示すためには、我々 は CCL15 と IL17F の 2 つのサイトカイン遺伝子のプロモーターを上映しました。さらに、eY1H 試金およびそれらの解決方法を実行する場合に発生する可能性のある問題の種類を説明するために失敗した画面からの結果を示す.

Protocol

1. 準備 Sc −U アリルメ プレート (150 mm ペトリ皿)注:これらのプレートは、DNA 餌酵母菌の成長のために使用されます。 ドロップ アウト ミックス、イースト窒素ベース (YNB)、アデニン hemisulfate 920 mL の水、5.9 (メディアのリットル当たり 1 mL; 構成の表 2を参照してください約) 5 M NaOH で pH のアンモニウムの硫酸塩を溶解します。2 L フラス?…

Representative Results

EY1H 試金から結果の分析と 3 つの主な要因を考慮すべき: DNA 餌ひずみのバック グラウンド レポーターの活動、TF DNA の相互作用、および肯定的なコロニーの数に対応するレポーターの活動の強さ。DNA の餌ひずみのバック グラウンド レポーターの活動 (すなわち、autoactivity) は、全体的な成長と TF 獲物がない場合でも、読み出しプレートの酵母コロニーの色を指します。理想的には、非 autoacti…

Discussion

ここで大きく説明ロボット eY1H 交尾スクリーニング アプローチは、以前のライブラリ スクリーニングと比較して興味や変換に基づく配列スクリーニング アプローチの DNA 領域にバインド TFs のセットを識別するためにスループットを向上します。アッセイは、TF ごとにテストしたすべての 4 つの植民地のために積極的、相互作用の 90% は同じ酵母 DNA 餌ひずみ10の独立した画…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、健康の国民の協会 [J.I.F.B. に R35-GM128625] によって支えられました。

Materials

3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength – Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150×15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

References

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome–development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

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Cite This Article
Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

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