Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específica da cóclea do rato

As freqüências na escala de aproximadamente 20 \ u201220, 000 hertz podem ser percebidas como estímulos auditivos por seres humanos. A audição humana é normalmente mais sensível perto de 1.000 Hz, onde o nível médio de pressão sonora é de 20 μPa em adultos jovens (ou seja, 0 decibéis de nível de pressão sonora [dB SPL]). Em algumas condições patológicas, a perda auditiva é restrita a frequências específicas. Por exemplo, nos estágios iniciais da perda auditiva induzida por ruído (pair), um “entalhe” (i.e., elevação do limiar auditivo) pode ser observado no audiograma a 4 kHz¹. Ao longo da partição coclear de mamíferos, suas gradações de rigidez e massa produzem um mapa de frequência exponencial, com detecção de som de alta frequência na base da cóclea e detecção de baixa frequência no ápice². De fato, há um mapa de localização-frequência coclear ao longo da membrana basilar, levando ao que é conhecido como organização tonotópica^2,3. Cada lugar dado na membrana basilar tem a sensibilidade a mais elevada a somente uma freqüência sadia particular, que seja denominada geralmente a freqüência característica^3,4, embora as respostas a outras freqüências possam igualmente ser observadas.

Até o momento, vários modelos de mouse têm sido empregados para investigar a função normal, processos patológicos e eficácia terapêutica no sistema auditivo. O conhecimento preciso dos parâmetros fisiológicos na cóclea do camundongo é um pré-requisito para esses estudos de perda auditiva. A cóclea do camundongo é dividida anatomicamente em curvas apical, média e basal, que correspondem a diferentes regiões de frequência. Ao rotular os aferentes do nervo auditivo no núcleo coclear para analisar seus locais de inervação periférica correspondentes na cóclea, Müller et al. conseguiram estabelecer o mapa de localização-frequência coclear no rato normal in vivo⁵. No intervalo de 7,2 – 10, 5kHz, o que corresponde a posições entre 90% e a dez% do comprimento total da membrana basilar, o mapa de localização-frequência da cóclea do rato pode ser descrito por uma função de regressão linear simples, sugerindo uma relação entre o distância normalizada da base coclear e o logaritmo da frequência característica⁵. Em camundongos de laboratório, o mapa de frequência local pode ser usado para explorar a relação entre limiares auditivos dentro de faixas de frequência específicas e cocleogramas mostrando o número de células ciliadas ausentes em regiões relativas ao longo da membrana basilar⁶. É importante ressaltar que o mapa de frequência local fornece um sistema de posicionamento para a investigação de danos estruturais mínimos, como danos às sinapses de fita de células ciliadas em locais específicos de frequência coclear em camundongos com trauma auditivo periférico^{7 ,8}.

Na cóclea de mamíferos, as sinapses da fita são compostas de uma fita pré-sináptica, uma projeção elétron-densa que amarras um halo de vesículas sinápticas prontas para liberação contendo glutamato dentro do IHC, e uma densidade pós-sináptica no terminal nervoso do Sgn com receptores de glutamato⁹. Durante a transdução do som coclear, a deflexão do feixe de células ciliadas resulta em despolarização do IHC, o que leva à liberação de glutamato de IHCs para os terminais aferentes pós-sinápticos, ativando assim a via auditiva. A ativação deste caminho conduz à transformação de sinais mecânicos som-induzidos em um código da taxa no SGN¹⁰. Na verdade, a sinapse de fita IHC é altamente especializada para transmissão de som incansável em taxas de centenas de hertz com alta precisão temporal, e é de importância crítica para mecanismos pré-sinápticos de codificação de som. Os estudos precedentes revelaram que as sinapses da fita variam extremamente no tamanho e no número em regiões diferentes da freqüência no rato adulto cóclea^11,12, refletindo provavelmente a adaptação estrutural à codificação sadia particular para necessidades de sobrevivência. Recentemente, estudos experimentais em animais demonstraram que a sinaptopatia coclear contribui para múltiplas formas de deficiências auditivas, incluindo perda auditiva induzida por ruído, perda auditiva relacionada à idade e perda auditiva hereditária^{13, 14}. assim, métodos para identificação de alterações correlatas no número, estrutura e função sináptica em regiões de frequência específica têm sido cada vez mais empregados em estudos de desenvolvimento auditivo e doença da orelha interna, utilizando modelos gerados via manipulação experimental de variáveis genéticas ou ambientais^15,16,17.

No presente relato, apresentamos um protocolo para analisar o número, a estrutura e a função sináptica em uma região de frequência específica da membrana basilar em camundongos adultos. A localização da frequência coclear é realizada utilizando-se um determinado mapa de frequência local em combinação com um cócleograma. As características morfológicas normais das sinapses da fita coclear são avaliadas via imunomarcação pré-sináptica e pós-synaptica. O estado funcional das sinapses da fita coclear é determinado com base nas amplitudes do estímulo da onda I de abr. Com pequenas alterações, este protocolo pode ser usado para examinar as condições fisiológicas ou patológicas em outros modelos animais, incluindo ratos, cobaias e gerbils.