İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

1. medya ve önemli arabellekleri hazırlanması 500 mL % 40 galaktoz toplam hacmi 500 mL için galaktoz ve de-iyonize su 200 gr ekleyerek hazırlayın. Isıtma levhası veya mikrodalga çözüm alma galaktoz oranı artırmak için kullanın. Steril cam şişe bağlı 0.2 µm filtre üst oluşan bir vakum filtrasyon aparatı ile steril filtre.Not: Tüm medya çözümleri de-iyonize su kullanılarak hazırlanır. 500 mL % 40 glikoz toplam hacmi 500 mL için 200 gr glikoz ve su ekleyerek hazırlayın. Sterilize etmek için basınçlı kap. Her dört 2 L şişe içine 0.4 g histidin (CSM-O’nun), 3.35 g maya azot amonyum sülfat (YNB + azot) ve 475 mL su ile temel olmadan tam ek karışımı ekleyin. Basınçlı kap. Son glikoz konsantrasyonu % 2 elde etmek için % 40 glikoz 25 mL ekleyin. Ekleme, bir cam şişe, 50 gr pepton ve 25 gr Maya özü ve 375 mL su. Basınçlı kap. 5 x % 10 galaktoz içeren Maya pepton (YP) çözüm vermek için % 40 galaktoz 125 mL ekleyin. Ekleme, 250 mL şişe için 0,04 g CSM-O’nun, 0,335 g YNB + azot ve su 47,5 ml. Basınçlı kap. CSM-O’nun 50 mL almak için % 40 glikoz 2.5 mL ekleyin YNB + % 2 glikoz. 1 L 1 M Tris pH 7,0 121.14 g Tris temel 800 mL su ile karıştırılarak hazır olun. PH 7,0 ulaşıncaya kadar konsantre hidroklorik asit ekleyin. 1 L son bir hacim için su ekleyin ve 0.2 µm filtreden geçmek. 0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 8.0 500 mL EDTA 73.06 g 400 mL su ile karıştırılarak hazır olun. Sodyum hidroksit pellets EDTA çözünmüş ve pH 8.0 ulaşır kadar ekleyin. 500 mL son bir hacim için su ekleyin ve 0.2 µm filtreden geçmek. 100 mM phenylmethanesulfonyl florür (PMSF) 100 mL PMSF 1,74 g 200 kanıt etanol ile karıştırarak hazırlayın. -20 ° C’de mağaza 2 x 50 mM Tris pH 7,0, 1,4 M NaCl, % 20 gliserol ve 1 mM EDTA pH 8.0 oluşan boncuk yıkama arabellek 225 mL hazırlayın. 100 mL boyutu dışlama Kromatografi arabelleği (S200 arabellek) 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic asit hidrat (MES) pH 6.5, 100 mM NaCl, % 2 gliserol ve %0.03 n-lauryl-beta-D-Maltopyranoside (demir) oluşan hazırlayın. 100 mL oluşan 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl ve % 10 gliserol membran resuspension arabelleği hazırlayın. 10 mL 3 SDS-sayfa yükleme boya x 3 mL % 20 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), 3 mL gliserol, 2.4 mL 1 M Tris pH 6.8, 0,03 g bromophenol mavi ve 1.6 mL 2-mercaptoethanol karıştırarak hazırlayın. 2. overexpression S. cerevisiae Bor ışınlama CSM-O’nun 50 mL üç dönüştürülmüş Maya kolonilerde aşılamak + 30 ° C’de 190 RPM YNB + % 2 glikoz medya ve shake gecede Ertesi gün, bir dalga boyu 600 optik yoğunluk belirlemek için bir Spektrofotometre kullanabilir nm (OD600) ve bir OD600 her her CSM-O’nun 500 mL içeren dört 2 L şişeler 0.01 aşılamak YNB + % 2 glikoz medya. 190 RPM hücrelere tüm glikoz tüketmek ve yüksek yoğunluklu için büyümeye izin vermek 30 h 30 ° C’de sallamak.Not: Daha uzun bir büyüme zaman daha büyük hücredeki sonuçlar verir, daha büyük hasat zar getiri, ve sonuçta daha büyük saf protein verir. İfade 125 mL % 10 galaktoz % 2 galaktoz son indüksiyon konsantrasyon için ile takıma 5 x YP medya ekleyerek teşvik. 16 h 30 ° C’de 190 RPM sallamak. Hasat hücreleri tarafından 4.000 x g 15 dakika süreyle de iplik 100 mL soğuk su hücrelerde Resuspend.Not: Bu noktada hücreleri-80 ° C’de süresiz olarak dondurulmuş olabilirler veya hazırlık hücre lizis ve membran hasat devam edebilir. Biz genellikle 40-45 g hücre hasat. 3. hasat Maya zarı İkisi de proteaz inhibitörleri hareket hücre resuspension 1 M Tris pH 7,0, 0,5 M EDTA 0,45 mL 11,25 mL ve 100 mM PMSF, ikinci 2,25 mL ekleyin. Son hacmi bir 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA ve 1 mM PMSF hücre resuspension arabellekte sonuçları 225 mL su ekleyin.Not: çünkü onlar kısmen donmuş kalırsa, onlar tarafından boncuk atan lizis direneceğini hücreleri donmuş kullanarak hücreleri iyice, yaklaşık 1 saat oda sıcaklığında erimek için izin. Hücre resuspension yenerek boncuk için 450 mL metal kutu içine ekleyin. Kalan cilt soğuk 0,5 mm cam boncuk ile kapalı üst. Boncuk atan odası ile rotor montaj ve bir buz banyosu içinde bırakın. Lysate aşırı ısınmayı önlemek için 2 dk dinlenme noktalarla ayrılmış altı 1 dk bakliyat gerçekleştirin. Bir vakum filtrasyonu cihaz bir cam şişe içine bir plastik tek kullanımlık şişe ilk filtre vidalı kullanarak birleştirin. Çünkü kalan plastik aygıt-ebilmek esir boncuk geçmek için lysate izin verirken filtrasyon zarının kaldırın. Boncuk boncuk atan odası vakum uygularken derlemenin üzerine içeriğini dökerek lysate ayırın. Boncuk atan odası 2 x 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1.4 M NaCl ve % 20 gliserol içeren yıkama arabelleği 225 mL ile yıkayın. Onları yıkamak için boncuk üzerine odası içeriğini temizleyin.Not: Yıkama ~ 450 mL lysed hücre son hacim verir ve önemli ölçüde artar hasat membran verimleri. Son konsantrasyonu 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, % 10 gliserol ve 700 mM NaCl ve tuz konsantrasyonu yükselen birincil amacı periferik membran proteinlerinin ayırmak yardımcı olmaktır. 15.000 x gde 15 dakika lysate hücre aşağı spin. Süpernatant polikarbonat şişe ve spin 135,000 x g membranlar toplamak için bir ultracentrifuge içinde de 1 h için içine dökün.Not: bir ultracentrifuge yoksa, membranlar 3 h 53.000 x g, zemin modeli santrifüjler içinde ulaşılabilir bir güç olarak iplik tarafından toplanabilir. Süpernatant atın ve membran granül ile şişe tartın. Membran granül 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl ve % 10 gliserol içeren yaklaşık 35 mL membran resuspension bir arabellek resuspend ve cam douncer ekleyin. Hasat membranlar kitle belirlemek için boş santrifüj tüpleri tartın.Not: bir verimli membran hasat membranlar ağırlığının yaklaşık % 20 hücreleri ağırlığını bu membran hasat için kullanılan eşit olur. Bu iletişim kuralı tipik hücre sayıları 40-45 g verir ve böylece aynı şekilde 8-9 g membranlar verimini bekliyoruz. Şimdi süresiz olarak-80 ° C’de depolanmış olabilir 50 mL konik tüpler içine Dounce homojenize membranlar ve aliquotNot: Bu deneme için genellikle iki aliquots, iki ayrı protein purifications bir orijinal hücrenin hazırlık yapılması izin vermek için yapılır. 4. solubilization ve Protein saflaştırma Bir ölçek için bir heyecan bar ve n-lauryl-β-D-Maltopyranoside (demir) kullanılan g membran başına 150 mg ekleyin. Protein buz üzerinde veya 4 ° C’de tutunuz.Not: DDM higroskopik ve kurutucu kullanılmadığı zaman-20 ° C’de bir cam kavanoza saklanmalıdır. Ayrıca, 4-5 gram saf protein bir kayda değer miktarda elde etmek için bir arıtma membran arasında kullanmak için normaldir. Membranlar çözülme ve son hacmi 15 mL g membran membran resuspension tampon 1 mM PMSF ve 20 mM imidazole pH 8.0 ile desteklenmiş başına getirmek. DDM ile kabı membranlar eklemek ve 4 ° C’de 1 h için ilave edinNot: Demir konsantrasyonu % 1 w/v olacak, ama zar proteinleri solubilization için g membran eklendi deterjan kitle haberdar olmak için daha önemlidir. 135,000 x g 4 ° C’de sigara çözündürüldükten malzeme cips için de 25 min için spin. Süpernatant 5 mikron şırınga filtre ile filtre. Örnek Peristaltik pompa tarafından ayarla 1 mL/dk 1 mL immobilize nikel benzeşme sütuna bir akış hızı için yük equilibrated 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, % 10 gliserol, 20 mM imidazole pH 8.0 ve % 0.05 DDM.Not: alt ifade proteinler için geliştirilmiş saflık ve verimleri 1 mL 5 mL sütun ve nikel kobalt iyonları yerine yerine benzeşme Kromatografi için kullanarak tespit edildi. Sütun 10 sütun birimleri 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, % 10 gliserol, 80 mM imidazole pH 8.0 ve % 0.05 içeren bir yıkama arabellek ile yıkayın DDM.Not: yıkama sırasında-ebilmek var olmak kullanılmış için 10-His-öğesini protein imidazole konsantrasyonu genellikle için teşekkür ederiz ve geliştirilmiş saflık olur daha yüksektir. 20 mM Tris pH 7,0, 200 mM NaCl, % 10 gliserol, 300 mM imidazole pH 8.0 ve % 0.05 içeren arabellek protein elute DDM. Eluate on 1 mL kesirler toplamak ve 4- Tris-glisin SDS-sayfa jel çözündürüldükten lysate ve yıkama kesirler ile birlikte çalıştırın. Genellikle 5-6 mL ve konsantre 500 µL veya daha az 4 ° C’de dondurulmuş benchtop santrifüj içinde 50 kDa kesme yoğunlaştırıcı hacmindeki hakkında havuzu tepe kesirlerNot: 500 µL boyutu dışlama Kromatografi (sn) sütunlar enjekte bir tipik maksimum birimdir. Bu noktada protein veya süresiz olarak-80 ° C’de depolanabilir sn devam Protein 0.2 µm spin sütun filtresi filtre ve S200 arabellekte equilibrated bir boyutu dışlama sütuna (Örneğin, Superdex-200) enjekte: %0,03 20 mM Mes pH 6.5, 100 mM NaCl ve % 2 gliserol DDM.Not: tahlil cross-linking sonraki oxazolidin için bir birincil Amin arabelleğe alma Aracısı içermemelidir. SN arabellekleri gerekirse, burada ne zaman Tris Mes için alışverişi bitmiş gibi değişimi için bir fırsattır. 4- Tris-glisin SDS-sayfasında tepe kesirler jel çalıştırın. Jel leke, saf tepe kesirleri toplamak ve 50 kDa-kesme yoğunlaştırıcı 4 ° C’de konsantre 280 nm dalga boyunda Absorbans ve mağaza-80 ° C’de süresiz olarak ölçerek protein konsantrasyonu belirlemek 5. oxazolidin tahlil Cross-linking 10 µL tepki 0,5 mg/mL protein S200 arabelleği, S200 arabelleği, su veya % 20 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), 1 µL % 1.5 oxazolidin 1 µL tarafından takip 5 µL 3 µL karıştırarak hazırlayın.Not: Bu 0.15 mg/mL protein ve % 0.15 oxazolidin 1 x tepki verecektir. SDS bir ön arıtma içeren örnekleri önemli negatif denetimleridir ve karışık ve 5 min için oda sıcaklığında inkübe oxazolidin eklemeden önce. Oda sıcaklığında 30 dakika tepki kuluçkaya. Reaksiyon 5µL SDS-sayfa jel boya, oxazolidin quenches Tris arabellek aşırı içeren yükleme x 3 ekleyerek bitirmek. Tüm 15 µL lane başına 1,5 µg protein-ecek yük % 4-20 Tris-glisin SDS-sayfa jel üzerine yükleyin. Jel 200 V 30 dk. leke çalıştırın ve kanıt denatüre monomer boyutunda iki kez çalışan bir grup tarafından dimer cross-linking ölçüde belirler.Not: Bir oxazolidin titrasyon ve zaman ders önce bir homomeric taşıyıcı için en iyi koşulları bulmak için gerçekleştirilebilir.