Expresión, solubilización y purificación de los transportadores de eucariotas borato de

1. preparación de medios y tampones importantes Preparar 500 mL de galactosa 40% agregar 200 g de galactosa y agua desionizada hasta un volumen total de 500 mL. Use una placa caliente o microondas para aumentar la velocidad de la galactosa en solución. Filtro estéril con un aparato de filtración de vacío consistente en una tapa de filtro de 0.2 μm unida a una botella de vidrio estéril.Nota: Todas las soluciones de medios de comunicación se preparan con agua desionizada. Preparar 500 mL de glucosa 40% agregar 200 g de glucosa y agua hasta un volumen total de 500 mL. Autoclave para esterilizar. En cada uno de los cuatro frascos de 2 L, agregar 0,4 g de mezcla completa suplemento sin histidina (CSM-su), 3,35 g levadura nitrógeno base con sulfato de amonio (YNB + nitrógeno) y 475 mL de agua. Autoclave. Añadir 25 mL de glucosa 40% para lograr una concentración final de glucosa de 2%. Añadir a una botella de cristal, peptona de 50 g y 25 g extracto de levadura y agua 375 mL. Autoclave. Añadir 125 mL de galactosa 40% dar 5 x solución de peptona (YP) de levadura que contenga 10% de galactosa. Agregar a un matraz de 250 mL, 0.04 g CSM-su, 0,335 g YNB + nitrógeno y agua a 47,5 mL. Autoclave. Añadir 2,5 mL de glucosa 40% para obtener 50 mL de CSM su YNB + 2% de glucosa. Preparar 1 L de Tris 1M pH 7.0 mezclando 121,14 g de Tris base en 800 mL de agua. Añadir ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH llegue a 7.0. Agregar agua hasta un volumen final de 1 L y pasar por un filtro de 0.2 μm. Preparar 500 mL de 0,5 M pH de ácido (EDTA) etilendiaminotetraacético 8.0 mezclando 73,06 g de EDTA con 400 mL de agua. Añadir gránulos de hidróxido de sodio hasta que el EDTA se haya disuelto y el pH alcanza 8.0. Agregar agua hasta un volumen final de 500 mL y pasar por un filtro de 0.2 μm. Preparar 100 mL de fluoruro de phenylmethanesulfonyl de 100 mM (PMSF) 1,74 g de PMSF de mezcla con etanol prueba 200. Almacenar a-20 ° C. Preparar 225 mL de 2 x de tampón de lavado del grano que consta de 50 mM de Tris pH 7.0, NaCl de 1,4 M, glicerol 20% y 1 mM EDTA pH 8.0. Preparar 100 mL del búfer de cromatografía de exclusión de tamaño (S200 tampón) que consta de 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic ácido hidrato (MES) pH 6.5, 100 mM NaCl, 2% de glicerol y 0.03% n-dodecil-beta-D-Maltopyranoside (DDM). Preparar 100 mL de buffer de resuspensión de membrana que consiste en 50 mM Tris, pH 7.0, 500 mM NaCl y glicerol al 10%. Preparar 10 mL de 3 x tinte de carga SDS-PAGE mezclando 3 mL 20% sodio dodecil sulfato (SDS), glicerol 3 mL, 2,4 mL 1M Tris pH 6.8, azul de bromofenol 0.03 g y 1,6 mL de 2-Mercaptoetanol. 2. sobreexpresión de transportador de borato en S. cerevisiae Sembrar tres colonias de levadura transformadas en 50 mL de CSM su + YNB + medios de glucosa de 2% y agitar durante la noche a 190 rpm a 30 ° C. Al día siguiente usar un espectrofotómetro para determinar la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm (OD600) y de inocular a un OD600 de 0.01 de cuatro frascos de 2 L que cada uno contiene 500 mL de CSM su YNB + medios de glucosa de 2%. Agite a 190 rpm a 30 ° C 30 h permitir que las células consumen glucosa todos y crecer a una alta densidad.Nota: Un tiempo de crecimiento rinde resultados en células más grandes, más grandes rendimientos de membrana cosechados, y rendimientos de proteína purificada en última instancia más grande. Inducen la expresión añadir 125 mL de 5 medios x YP suplementado con 10% de galactosa para una concentración final de la inducción de la galactosa del 2%. Agite a 190 rpm a 30 ° C por 16 h. Cosecha de células por giro a 4.000 x g durante 15 min resuspender las células en 100 mL de agua fría.Nota: en este punto las células pueden ser congeladas a-80 ° C por tiempo indefinido, o puede continuar la preparación en lisis celular y la membrana cosecha. Cosecha típicamente 40-45 g de células. 3. cosecha de levadura membranas Añadir a la resuspensión de células 11,25 mL de Tris 1M pH 7.0, 0,45 mL de EDTA de 0,5 M y 2,25 mL de 100 mM PMSF, el último dos de los cuales actúan como inhibidores de la proteasa. Agregar agua hasta un volumen final de 225 mL, que se traduce en un buffer de resuspensión de células de 50 mM Tris pH 7.0, EDTA, 1 mM y 1 mM PMSF.Nota: Si utilizando congelados células permite células descongelar completamente, aproximadamente 1 h a temperatura ambiente, porque si permanecen parcialmente congelados, resisten lisis por paliza de grano. Añadir la resuspensión de células en un bote de metal de 450 mL para grano superando. Rematar el volumen restante con perlas de vidrio frío 0,5 mm. Montar una cámara de grano-golpeo con el rotor y sumergirlas en un baño de hielo. Realizar seis pulsos de 1 minuto, separados por períodos de descanso de 2 minutos para evitar el sobrecalentamiento del lisado. Montar un aparato de filtración de vacío utilizando un plástico botella desechable filtro atornillado en una botella de vidrio. Quitar la membrana de filtración, porque el dispositivo plástico restante puede capturar los granos permitiendo lisado para pasar. Separar los granos de lisado vertiendo el contenido de la cámara de paliza de grano en la Asamblea mientras se aplica el vacío. Lavar la cámara de golpes del grano con 225 mL de 2 x de tampón de lavado que contiene 50 mM Tris, pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1,4 M de NaCl y 20% de glicerol. Vacíe el contenido de la cámara sobre los granos para lavarlos.Nota: El lavado da un volumen final de ~ 450 mL lisada y significativamente membrana cosechada aumenta los rendimientos. Las concentraciones finales son 700 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF y glicerol al 10%, y el propósito principal de elevar la concentración de sal es ayudar a disociar las proteínas periféricas de membrana. Desactivación de la célula lisada por 15 min a 15.000 x g. Vierta el sobrenadante en botellas de policarbonato y vuelta por 1 h a 135.000 x g en una ultracentrífuga para recoger las membranas.Nota: Si no hay una ultracentrífuga, las membranas se pueden recoger por spinning por 3 h a 53.000 x g, una fuerza que es realizable en centrífugas de piso modelo. Deseche el sobrenadante y pesar las botellas con las pelotillas de la membrana. Vuelva a suspender los pellets de membrana en aproximadamente 35 mL membrana resuspensión tampón que contiene 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl y 10% de glicerol y añadir a un douncer de vidrio. Pesar los tubos de centrífuga de vacío para determinar la masa de las membranas cosechadas.Nota: En una cosecha eficiente de membrana, el peso de las membranas es igual a aproximadamente el 20% el peso de las células utiliza para la cosecha de esa membrana. Este protocolo da rendimientos de la célula típica de 40-45 g, y así además esperar un rendimiento de membranas g 8-9. Dounce homogeneizar las membranas y Alicuotar en tubos cónicos de 50 mL que ahora pueden ser almacenados indefinidamente a-80 ° C.Nota: Para este experimento, por lo general dos alícuotas se hacen, para permitir dos purificaciones de proteínas separadas realizar desde una preparación original de la célula. 4. solubilidad y purificación de proteínas A un vaso de precipitados agregar una barra de agitación y 150 mg de n-dodecil-β-D-Maltopyranoside (DDM) por membrana g se utiliza. Mantener la proteína en el hielo o a 4 ° C en todo momento.Nota: DDM es higroscópico y debe almacenarse en un tarro de cristal con desecante a-20 ° C cuando no esté en uso. También, es típico usar entre 4 a 5 g de las membranas de purificación para obtener una cantidad apreciable de proteína pura. Descongelar las membranas y llevar a un volumen final de 15 mL por g de membrana en membrana resuspensión buffer suplementado con 1 mM PMSF y 20 mM imidazol pH 8.0. Añadir las membranas en el vaso con DDM y revuelva durante 1 h a 4 ° C.Nota: La concentración de DDM será 1% w/v, pero para la solubilización de proteínas de la membrana es más crítico a tener en cuenta la masa de detergente añadido por membrana g. Spin 25 min a 135.000 x g a 4 ° C para material no solubilizado de pellets. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 5 μm. Equilibrado de carga de la muestra por la bomba peristáltica se establece en un caudal de 1 mL/min en una columna de afinidad de níquel inmovilizado 1 mL en 20 mM de Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% glicerol, 20 mM imidazol pH 8.0 y 0.05% DDM.Nota: Para menor expresa proteínas, rendimientos y mayor pureza se observaron mediante un 1 mL en lugar de la columna de 5 mL y el níquel en lugar de los iones de cobalto para la cromatografía de afinidad. Lavar la columna con 10 volúmenes de columna de un tampón de lavado que contiene 20 mM Tris, pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% glicerol, 80 mM imidazol pH 8.0 y 0.05% DDM.Nota: La concentración de imidazol que puede ser utilizada durante el lavado para una proteína 10 su etiquetado es superior es comúnmente apreciado y resulta en mayor pureza. Eluir la proteína en el búfer que contiene 20 mM Tris, pH 7.0, 200 mM NaCl, 10% glicerol, 300 mM imidazol pH 8.0 y 0.05% DDM. Recoger el eluido en diez fracciones de 1 mL y correr en un gel de SDS-PAGE de Tris glicina 4-20% junto con fracciones solubles de lisado y lavar. Fracciones del pico de la piscina, generalmente cerca de 5-6 mL y concentrado a 500 μl o menos volumen en un concentrador de corte de 50 kDa en una centrífuga de mesa refrigerada a 4 ° C.Nota: 500 μl es un volumen máximo típico inyectado en columnas de cromatografía (SEC) de exclusión de tamaño. En este punto la proteína pueden ser almacenadas indefinidamente a-80 ° C o continuar por la SEC. Filtro de la proteína a través de un filtro de 0.2 μm spin columna e inyectar en una columna exclusión tamaño (por ejemplo, Superdex 200) equilibrada en tampón S200: 20 mM Mes pH 6.5, 100 mM NaCl, 2% de glicerol y 0.03% DDM.Nota: Para el glutaraldehído subsecuente análisis del cross-linking, el neutralizante no debe contener una amina primaria. SEC es una oportunidad para intercambiar búferes si es necesario, como hace aquí al Tris de cambiar de Mes. Ejecutar que las fracciones de pico en un Tris glicina 4-20% SDS-PAGE gel. El gel de la mancha, recoger fracciones de puro pico y concentrarse en un concentrador de corte kDa 50 a 4 ° C. Determinar la concentración de proteína mediante la medición de la absorbancia a una longitud de onda de 280 nm y almacenar indefinidamente a-80 ° C. 5. análisis del cross-linking de glutaraldehído Preparar una reacción μl 10 mezclando 3 μl de proteína de 0.5 mg/mL en tampón de S200, 5 μl de tampón de la S200, 1 μl de agua o 20% sodio dodecil sulfato (SDS), seguido de 1 μl de glutaraldehido de 1.5%.Nota: Esto le dará una reacción de 1 x de glutaraldehído de 0,15 mg/mL de proteína y 0.15%. Las muestras que contienen un tratamiento previo de la SDS son controles negativos importantes y deben ser mezcladas y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de agregar el glutaraldehído. Incubar la reacción durante 30 min a temperatura ambiente. Terminar la reacción mediante la adición de 5μl de 3 x gel de SDS-PAGE carga colorante, que contiene un exceso de tampón de Tris que apaga el glutaraldehído. Todos 15 μl en gel de SDS-PAGE de Tris glicina 4-20%, que cargará 1,5 μg proteína por carril de la carga. Correr el gel a 200 V durante 30 minutos la mancha y determinar el grado de dimer reticulación por la evidencia de una banda que va en dos veces el tamaño del monómero desnaturalizado.Nota: Una valoración de glutaraldehído y curso del tiempo pueden realizarse primero para encontrar las mejores condiciones para un transportador de homomeric.