Expressão, solubilização e purificação de transportadores eucarióticas borato

1. preparação de mídia e importantes buffers Prepare 500 mL de galactose 40% adicionando-se 200 g de água desionizada e galactose para um volume total de 500 mL. Use uma placa quente ou microondas para aumentar a taxa de galactose entrar em solução. Filtro estéril com um aparelho de filtração de vácuo consiste em um filtro de 0,2 µm top ligado a um frasco de vidro estéril.Nota: Todas as soluções de mídia são preparadas com água desionizada. Prepare 500 mL de glicose 40% adicionando-se 200 g de glicose e água para um volume total de 500 mL. Autoclave para esterilizar. Em cada um dos quatro frascos 2L, adicione 0,4 g de mistura completa suplemento sem histidina (CSM-His), 3,35 g fermento nitrogênio base com sulfato de amônio (YNB + nitrogênio) e 475 mL de água. Autoclave. Adicione 25 mL de 40% de glicose para obter uma concentração final de glicose 2%. Adicionar, para um frasco de vidro, peptona de 50 g e 25 g de extrato de levedura e de 375 mL de água. Autoclave. Adicione 125 mL de galactose 40% dar 5 x solução de levedura peptona (YP) contendo 10% de galactose. Adicionar, para um balão de 250 mL, 0,04 g CSM-His, g 0,335 YNB + nitrogênio e água a 47,5 mL. Autoclave. Adicionar 2,5 mL de 40% de glicose para obter 50 mL do CSM-sua YNB + 2% de glicose. Prepare 1 L de 1M Tris pH 7.0 misturando 121,14 g de Tris base com 800 mL de água. Adicione ácido clorídrico concentrado até pH 7,0. Adicionar água até um volume final de 1 L e passar por um filtro de 0,2 µm. Prepare 500 mL de 0,5 M pH de ácido (EDTA) etilenodiaminotetracético 8.0 misturando 73,06 g de EDTA com 400 mL de água. Adicione hidróxido de sódio até dissolver o EDTA e o pH atinge 8.0. Adicionar água até um volume final de 500 mL e passar por um filtro de 0,2 µm. Prepare 100 mL de fluoreto de phenylmethanesulfonyl de 100 mM (PMSF) misturando 1,74 g de PMSF com etanol prova 200. Loja a-20 ° C. Prepare a 225 mL de tampão de lavagem do grânulo, consistindo de pH 7.0 do Tris de 50 milímetros 1,4 M NaCl, glicerol 20% e pH de 1 mM EDTA 8.0 de 2x. Prepare 100 mL do buffer de cromatografia de exclusão de tamanho (S200 tampão) consistindo de 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic ácido hidratado (MES) pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% de glicerol e 0,03% n-dodecil-beta-D-Maltopyranoside (DDM). Prepare 100 mL de tampão de ressuspensão de membrana consistindo de 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM de NaCl e 10% de glicerol. Prepare-se 10 mL de uma tintura do carregamento SDS-PAGE de 3x misturando 3 mL 20% Dodecil sulfato de sódio (SDS), glicerol 3 mL, 2,4 mL 1M Tris pH 6,8, 0,03 g de azul de bromofenol e 1,6 mL 2-Mercaptoetanol. 2. a superexpressão do transportador de borato em S. cerevisiae Inocular três colônias de fermento transformado em 50 mL de CSM-His + YNB + 2% de glicose media e agitar durante a noite a 190 rpm a 30 ° C. No dia seguinte usar um espectrofotômetro para determinar a densidade óptica em um comprimento de onda de 600 nm (OD600) e inocular a uma OD600 de 0,01 cada de quatro frascos de 2 L, que cada um contém 500 mL do CSM-sua mídia de glicose 2% + YNB. Agite a 190 rpm a 30 ° C para 30 h permitir que as células consumir todos glicose e crescer para um high-density.Nota: Um tempo de crescimento resulta em maior célula produz, maiores rendimentos colhidos da membrana, e, finalmente, a maior proteína purificada produz. Induzi a expressão adicionando 125ml de 5 x YP mídia, suplementado com 10% de galactose para uma concentração final de indução de galactose de 2%. Agite a 190 rpm a 30 ° C, durante 16 h. Colheita de células por fiação a 4.000 x g durante 15 min. Ressuspender as células em 100 mL de água fria.Nota: neste ponto as células podem ser congeladas a-80 ° C indefinidamente ou continua a preparação para lise celular e a membrana da colheita. Nós colhemos normalmente 40-45 g de células. 3. a colheita das membranas de levedura Adicione a ressuspensão de célula 11,25 mL de 1M Tris pH 7.0, 0,45 mL de EDTA 0,5 M e 2,25 mL de 100 mM PMSF, este último, dois dos quais atuam como inibidores de protease. Adicione água até um volume final de 225 mL, o que resulta em um buffer de ressuspensão de célula de 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA e 1 mM PMSF.Nota: Se usar congelados células permitem que células descongelar completamente, cerca de 1h à temperatura ambiente, porque se eles permanecem parcialmente congelados, eles resistirão lise pelo espancamento do grânulo. Adicione a ressuspensão de célula em uma vasilha de metal 450 mL para grânulo batendo. Acima do volume restante com contas de vidro frio 0,5 mm. Montar uma câmara do grânulo batendo com o rotor e mergulhe em um banho de gelo. Realize seis pulsos de 1 min, separados por períodos de repouso de 2 min para evitar o superaquecimento do lisado. Monte um aparelho de filtração de vácuo usando um plástico garrafa descartável filtro superior parafusado dentro de uma garrafa de vidro. Remova a membrana de filtração, porque o dispositivo de plástico restante pode capturar os grânulos permitindo lisado para passar. Separe as contas o lisado derramando o conteúdo da câmara de espancamento do grânulo em assembleia durante a aplicação do vácuo. Lave a câmara de espancamento do grânulo com 225 mL de um tampão de lavagem que contém 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, 1mm PMSF, 1.4 M NaCl e 20% de glicerol de 2x. Esvazie o conteúdo da câmara sobre as contas de lavá-las.Nota: A lavagem dá um volume final de células ~ 450 mL lysed e significativamente produz aumentos membrana colhidos. As concentrações finais são 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, 1mm PMSF, 10% de glicerol e 700 mM de NaCl, e o objetivo principal de elevar a concentração de sal é ajudar se dissociam proteínas periféricas da membrana. Spin para baixo a célula lisada por 15 min a 15.000 x g. Despeje o líquido sobrenadante garrafões de policarbonato e rotação por 1h a 135.000 x g em um se coletar membranas.Nota: Se um se não estiver disponível, as membranas podem ser recolhidas por fiação para 3h a 53.000 x g, uma força que é realizável em centrífugas de andar modelo. Desprezar o sobrenadante e pesar as garrafas com as pelotas de membrana. Resuspenda as pelotas de membrana em aproximadamente 35 mL membrana ressuspensão tampão contendo Tris pH 7.0, 500 mM de NaCl e 10% glicerol de 50mm e adicionar a um douncer de vidro. Pese os tubos de centrífuga vazio para determinar a massa das membranas colhidas.Nota: Em uma colheita eficiente da membrana, o peso das membranas será igual a aproximadamente 20% do peso de células usado para essa colheita de membrana. Este protocolo dá rendimentos de célula típica de 40-45 g, e, assim, da mesma forma esperamos um rendimento de membranas de 8-9 g. Homogenizacao homogeneizar as membranas e a alíquota para tubos de 50ml cónico que agora podem ser armazenados indefinidamente a-80 ° C.Nota: Para este experimento, tipicamente duas alíquotas são feitas, para permitir que duas purificações de proteína separada ser executada a partir de uma preparação da pilha original. 4. solubilização e purificação de proteínas Para um copo de adicionar uma barra de agitação e 150 mg de n-dodecil-β-D-Maltopyranoside (DDM) por membrana g sendo usada. Manter as proteínas no gelo ou a 4 ° C em todos os momentos.Nota: DDM é higroscópico e deve ser armazenado em um frasco de vidro com dessecante em-20 ° C, quando não estiver em uso. Além disso, é típico para usar entre 4-5 g de membranas em uma purificação para obter uma quantidade apreciável de proteína pura. Descongelar as membranas e trazer até um volume final de 15 mL por membrana g no buffer de ressuspensão de membrana suplementado com 1mm PMSF e pH 8.0 do imidazole de 20 mM. Adicionar as membranas para o copo com DDM e agitar durante 1 h a 4 ° C.Nota: A concentração de DDM será 1% p/v, mas para a solubilização de proteínas de membrana é mais crítico para estar ciente da massa de detergente adicionado por membrana de g. Girar para 25 min a 135.000 x g a 4 ° C, de material não-solubilizado de Pelotas. Filtre o sobrenadante através de um filtro de seringa de 5 µm. A amostra pela bomba peristáltica definida como uma taxa de fluxo de 1 mL/min para uma coluna de afinidade de níquel imobilizado 1ml de carga equilibrada em 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol, pH 8.0 do imidazole de 20 mM e 0,05% DDM.Nota: Para baixas expressando proteínas, rendimento e pureza melhorada foram observado usando um 1 mL em vez de coluna de 5 mL e níquel em vez de íons de cobalto para cromatografia de afinidade. Lavar a coluna com 10 volumes de coluna de um tampão de lavagem, contendo 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol, pH 8.0 do imidazole de 80 mM e 0,05% DDM.Nota: A concentração de imidazol que pode ser usada durante as lavagens para uma proteína de 10-sua-Tag é maior do que comumente é apreciada e resulta em maior pureza. Eluir a proteína no buffer contendo 20 mM Tris pH 7.0, 200 mM NaCl, 10% de glicerol, pH 8.0 do imidazole de 300mm e 0,05% DDM. Recolher o eluato em dez frações de 1 mL e executar em um gel de SDS-PAGE de Tris-glicina 4-20% juntamente com frações de lisado e lave solubilizados. Fracções de pico de piscina, geralmente aproximadamente 5-6 mL e concentrado a 500 µ l ou menos volume em um concentrador de corte de 50 kDa em uma centrífuga de bancada refrigerada a 4 ° C.Nota: 500 µ l é um típico volume máximo injetado em colunas de cromatografia (SEC) de exclusão de tamanho. Neste ponto, a proteína pode ser armazenado por tempo indeterminado a-80 ° C ou continue na SEC. Filtrar a proteína através de um filtro de coluna de rotação de 0,2 µm e injetar em uma coluna de exclusão tamanho (por exemplo, Superdex-200) incubada no buffer S200: 20mm Mes pH 6,5, 100 mM de NaCl, 2% de glicerol e 0,03% DDM.Nota: Para o glutaraldeído subsequente do cross-linking do ensaio, o agente tamponador não deve conter uma amina primária. S é uma oportunidade para troca de amortecedores, se necessário, como feito aqui quando trocando Tris por Mes. Execute que as frações de pico em um 4-20% Tris-glicina SDS-PAGE do gel. Manchar o gel, coletar frações de pico puro e concentrar-se em um concentrador de kDa-corte 50 a 4 ° C. Determinar a concentração de proteína através da medição da absorvância no comprimento de onda de 280 nm e a loja indefinidamente a-80 ° C. 5. glutaraldeído cross-linking do ensaio Prepare uma reação de 10 µ l misturando 3 µ l de proteína de 0,5 mg/mL em buffer S200, 5 µ l de tampão S200, 1 µ l de água ou 20% sulfato dodecyl de sódio (SDS), seguido de 1 µ l de 1,5% de glutaraldeído.Nota: Isto vai dar uma reação 1x de 0,15 mg/mL proteína e 0,15% de glutaraldeído. Amostras contendo um pré-tratamento da SDS são controles negativos importantes e devem ser misturadas e incubadas à temperatura ambiente por 5 min antes de adicionar o glutaraldeído. Incube a reação por 30 min à temperatura ambiente. Terminar a reação adicionando 5µL de 3x do gel de SDS-PAGE carregando a tintura, que contém um excesso de tampão Tris que sacia o glutaraldeído. Carrega todos os 15 µ l em gel de SDS-PAGE de Tris-glicina 4-20%, que carregará a 1,5 µ g proteína por faixa. Funcione o gel a 200 V para 30 min. mancha e determinar a extensão do dímero do cross-linking pela evidência de uma banda que executa duas vezes o tamanho do monômero desnaturado.Nota: Um curso de tempo e titulação de glutaraldeído podem ser a primeira para encontrar as melhores condições para um transporte de homomeric.