式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

1. メディアと重要なバッファーの準備 ガラクトースと脱イオン水の 200 g を 500 mL の容量に追加することによって 40% ガラクトースの 500 mL を準備します。ホット プレートや電子レンジを使用して、ソリューションにガラクトースの率を高めます。0.2 μ m フィルター滅菌ガラスのビンを上部から成る真空ろ過装置と滅菌フィルター。注: すべてのメディア ソリューションは、脱イオン水を使用して準備されます。 グルコースと水の 200 g を 500 mL の容量に追加することによって 40% ブドウ糖 500 mL を準備します。オートクレーブ滅菌します。 4 の 2 L フラスコに、ヒスチジン (CSM 彼)、3.35 g 酵母窒素アンモニウムの硫酸塩 (YNB + 窒素)、475 ミリリットルの水でなく完全な補完物 0.4 g を追加します。オートクレーブ。2% の最終的なグルコース濃度を達成するためにグルコースを 40 mL を追加します。 追加、ガラス瓶、50 g ペプトンと 25 グラム酵母エキスと 375 mL に水します。オートクレーブ。5 x 10% ガラクトースを含む酵母ペプトン (YP) ソリューションを与える 40% ガラクトースの 125 mL を追加します。 0.04 g を 250 mL のフラスコに追加 CSM-彼の 0.335 g YNB + 窒素・ 47.5 mL に水。オートクレーブ。2.5 mL 40% ブドウ糖 50 mL CSM 彼を得るための追加 YNB + 2% ブドウ糖。 800 mL の水で、トリス基本 121.14 g を混合することによって 1 M トリス pH 7.0 の 1 L を準備します。PH は、7.0 に達するまでは、濃塩酸を追加します。1 L の最終巻に水を追加し、0.2 μ m フィルターを通過します。 400 mL の水と EDTA の 73.06 g を混ぜて 0.5 M エチレンジアミン四酸 (EDTA) pH 8.0 の 500 mL を準備します。EDTA が解散し、pH 8.0 に達するまでは、水酸化ナトリウムのペレットを追加します。500 mL の最終巻に水を追加し、0.2 μ m フィルターを通過します。 200 証拠エタノール PMSF の 1.74 g を混ぜて 100 mM phenylmethanesulfonyl フッ化物 (PMSF) 100 mL を準備します。-20 ° C にてストア 225 mL の 2 倍の 50 mM トリス pH 7.0, 1.4 M NaCl、20% グリセロールと 1 mM EDTA pH 8.0 で構成されるビーズ洗浄バッファーを準備します。 20 mM 4 Morpholinoethanesulfonic 酸水和物 (MES) pH 6.5 では、100 mM の NaCl、2% グリセロールと 0.03 %n-ドデシル-ベータ-D-Maltopyranoside (DDM) から成る、サイズ排除クロマトグラフィー バッファー (S200) 100 mL を準備します。 100 mL の 50 mM トリス pH 7.0, 500 mM, NaCl と 10% グリセロールから成る膜再懸濁バッファーを準備します。 1.6 mL 2-メルカプトエタノール、0.03 g ブロモフェノールの青、2.4 mL 1 M トリス pH 6.8 グリセロール 3 mL 3 mL 20% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) を混ぜて × SDS ページ読み込み染料 3 の 10 mL を準備します。 2.酵母のホウ酸トランスポーターの発現 50 ml の CSM 彼の 3 つの変換されたイースト コロニーを接種 + 30 ° C で 190 rpm で一晩 YNB + 2% グルコース メディアやふれ 次の日は、600 の波長で光の密度を決定する分光光度計を使用して nm (外径600) 各 4 2 L フラスコをそれぞれ含む CSM 彼の 500 mL の 0.01 外径600に接種して YNB + 2% グルコース メディア。 すべてのグルコースを消費し、高密度成長する細胞を許可する 30 h 30 ° C で 190 rpm で横に振る。注: 成長時間が長くより大きいセルの結果の結果が、大きい収穫膜利回り、最終的に大きい精製タンパク質が得られます。 5 x YP 培地 2% ガラクトースの最終的な誘導濃度 10% ガラクトースの 125 mL を追加することによって式を誘導します。16 h 30 ° C で 190 rpm で横に振る。 4,000 x gで 15 分間で回転による収穫細胞では、100 mL の冷たい水で細胞を再懸濁します。注: この時点で細胞が凍結される-80 ° C で無期限に、またはセル換散および膜の収穫に引き続き、準備。我々 は通常細胞の 40-45 g を収穫します。 3. 酵母の膜の収穫 プロテアーゼ阻害剤として行動する 2 つのセルの巻き上がり 1 M トリス pH 7.0 では、0.5 M の EDTA の 0.45 mL 11.25 mL と 100 mM PMSF、後者の 2.25 mL を加えます。225 mL の 50 mM Tris pH 7.0 では、1 mM EDTA、および 1 mM PMSF のセル再懸濁バッファー内の結果の最終巻に水を追加します。注: ビーズ叩いて、換散を抵抗する場合は部分的に固定されたまま、ので、凍結細胞を使用してに徹底的に、常温で約 1 時間の解凍が細胞を許可するかどうか。 ビーズを破っての 450 mL 金属キャニスターにセルの巻き上がりを追加します。冷たい 0.5 mm のガラスビーズを残りのボリュームの締めくくり。 ローターとビーズの商工会議所を組み立てるし、氷水に浸します。ライセートの過熱を防ぐために 2 分残りピリオドで区切られた 6 の 1 分のパルスを実行します。 ガラス瓶の中にプラスチック製の使い捨てボトル上部フィルターねじ込みによる吸引ろ過装置を組み立てます。残りのプラスチック製のデバイスを渡すライセートを許可しながら、ビーズをキャプチャできるため、ろ過膜を削除します。ライセートからアセンブリを真空の適用中にビーズ暴行部屋の内容を注ぐことによってビーズを分離します。 225 ml 50 mM Tris pH 7.0 では、1 mM EDTA、1 mM PMSF、1.4 M の NaCl および 20% のグリセロールを含む洗浄バッファー x 2 のビード暴行商工会議所を洗います。それらを洗浄するためにビーズの上に商工会議所の内容を空にします。注意: 洗浄分離 〜 450 mL 細胞の最終巻と大幅増加収穫された膜が得られます。最終濃度 50 mM Tris pH 7.0 では、1 mM EDTA、1 mM PMSF、10% グリセロールと 700 mM の NaCl、塩分濃度を高めることの主な目的は周辺膜蛋白質を分離します。 細胞ライセート 15,000 × gで 15 分間スピンダウンします。ポリカーボネート瓶と膜を収集する超遠心機で 135,000 x gで 1 h のスピンに上澄みを注ぐ。注: 超遠心機が利用できない場合膜は 53,000 x g、床モデルの遠心分離機の達成力で 3 時間回して収集可能性があります。 上澄みを廃棄し、膜ペレットとボトルの重量を量る。50 mM Tris pH 7.0 では、500 mM の NaCl、および 10% グリセロールを含む膜再懸濁約 35 mL バッファー内膜ペレットを再懸濁します、ガラス douncer に追加します。収穫された膜の質量を決定する空遠沈管の重量を量る。注: 効率的な膜収穫、膜の重量に等しくなります膜収穫用セルの重量約 20%。このプロトコルは 40-45 g の典型的な細胞収率を与える、従って私達は同様に 8-9 g 膜の収率を期待します。 Dounce 均質膜、そして因数-80 ° C で不明確に保存されるかもしれない今 50 mL の円錐管に注: この実験では、通常 2 つの因数作られています、1 つの元のセルの準備から実行する 2 つの別々 の蛋白質精製できるように。 4. 可溶化およびタンパク質の精製 ビーカーに攪拌棒と n-ドデシル-β-D-Maltopyranoside (DDM) 使用されている g 膜ごとの 150 mg を追加します。蛋白質または 4 ° C で氷の上を保つため、すべての回で。注: DDM は吸湿性、使用しないときは-20 ° C で乾燥剤をガラスの瓶に保存する必要があります。また、純粋な蛋白質のかなりの量を取得する浄化膜の 4-5 g 間で使用する一般的なです。 膜を融解し、g 膜膜再懸濁バッファー 1 mM PMSF と 20 mM のイミダゾール pH 8.0 補われるあたり 15 mL の最終巻。DDM とビーカーに膜を追加し、4 ° C で 1 時間攪拌注: DDM 濃度 1 %w/v になりますが、膜タンパク質の可溶化 g 膜ごと追加洗剤量を認識するより重要であります。 非溶解材料をペレットへの 4 ° C で 135,000 x gで 25 分のスピンします。上清を 5 μ m のシリンジ フィルターをフィルターします。 蠕動ポンプによってサンプル 1 mL 固定化ニッケル アフィニ ティー ・ カラムに 1 mL/min の流量に設定負荷平衡 0.05%、20 mM のイミダゾール pH 8.0、10% グリセロール 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM の NaCl の DDM。注: 低発現蛋白質のため改良された純度・収量を用いて観察された 1 mL 5 mL 列、およびコバルト イオンではなくニッケルではなくアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーのため。 0.05%、80 mM のイミダゾール pH 8.0、10% グリセロール 20 mM Tris pH 7.0 では、500 mM の NaCl を含む洗浄バッファーの 10 列ボリュームを洗い流す DDM。注: 10 彼タグ付きタンパク質の洗浄時に使用できるイミダゾールの集中は一般的に高く評価されており、改良された純度の結果よりも高い。 0.05%、300 mM のイミダゾール pH 8.0、10% グリセロール 20 mM Tris pH 7.0 では、200 mM の NaCl を含むバッファーにタンパク質を溶出 DDM。10 1 mL で溶出液を収集し、, 可溶化ライセートと洗って分数とともに 4 20% トリス-グリシン-SDS のページ ゲルでランします。 通常 5-6 mL の濃縮液 500 μ L 以下 4 ° C で冷蔵ベンチトップ遠心分離機で 50 kDa カットオフ コンセントレーターのボリューム、プール ピーク画分注: 500 μ L は典型的な最大ボリューム サイズ排除クロマトグラフィ (SEC) カラムに注入です。この時点で蛋白質は-80 ° C で不明確に保存されるかもしれないまたは秒に続き 0.2 μ m 回転カラム フィルターを通してタンパク質をフィルターし、S200 バッファーのサイズ排除カラム (例えば、 Superdex 200) に注入: 0.03%、2% のグリセロール、20 mM Mes pH 6.5 では、100 mM の NaCl DDM。メモ: 以降グルタルアルデヒド架橋試金、緩衝剤は第一級アミンを含まれてはいません。Mes のトリスを交換するときにここで行うと、必要に応じてバッファーを交換する機会です。 ピーク分数 4 20% トリス-グリシンの SDS ページのゲルを実行します。ゲルを染色、純粋なピーク画分を収集、4 ° C で 50 kDa カットオフ コンセントレーターに集中 -80 ° C で無期限にストアの 280 nm の波長で吸光度を測定することによってタンパク質の濃度を測定します。 5. グルタルアルデヒド架橋法 S200 バッファー、S200 バッファー、1 μ L の水または 20% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、1.5% グルタルアルデヒドの 1 μ L に続いての 5 μ L で 0.5 mg/mL 蛋白質の 3 μ L を混合することによって 10 μ L 反応を準備します。注: これは 0.15 mg/mL タンパク質と 0.15% グルタルアルデヒドの 1 x 反作用を与えます。SDS の前処理を含むサンプルは重要なマイナス コントロールし混合し、グルタルアルデヒドを追加する前に 5 分間室温でインキュベートする必要があります。 室温で 30 分間反応を孵化させなさい。ローディングの染料、グルタルアルデヒドを消光 Tris バッファーの過剰を含む SDS ページのゲル x 3 の 5µL を追加することで反応を停止させます。 1 レーンあたり 1.5 μ g のタンパク質を読み込む 4 20% トリス-グリシン-SDS のページ ジェルの上に 15 μ L すべてをロードします。200 V で 30 分間染色でゲルを実行し、変性の単量体のサイズの 2 倍で動作するバンドの証拠によってダイマー架橋の程度を決定します。注: グルタルアルデヒド滴定と時間経過が行われる最初 homomeric トランスポーターの最適な条件を見つけること。