Espressione, solubilizzazione e purificazione dei trasportatori eucariotiche borato

1. preparazione dei media e importante buffer Preparare 500 mL di 40% galattosio aggiungendo 200 g di galattosio e acqua deionizzata per un volume totale di 500 mL. Utilizzare una piastra riscaldante o forno a microonde per aumentare il tasso di galattosio entrare in soluzione. Filtro sterile con un apparato di filtrazione sotto vuoto composto da un top di filtro 0,2 µm attaccato ad una bottiglia di vetro sterile.Nota: Tutte le soluzioni di media sono preparate con acqua deionizzata. Preparare 500 mL di glucosio 40% aggiungendo 200 g di glucosio e l’acqua ad un volume totale di 500 mL. Autoclave per sterilizzare. In ciascuno dei quattro palloni 2L, aggiungere 0,4 g di miscela integratore completo senza istidina (CSM-His), 3,35 g lievito azoto base con solfato di ammonio (YNB + azoto) e 475 mL di acqua. Sterilizzare in autoclave. Aggiungere 25 mL di glucosio 40% per ottenere una concentrazione di glucosio nel finale del 2%. Aggiungere, una bottiglia di vetro, peptone g 50 e 25 g di Estratto di lievito e acqua a 375 mL. Sterilizzare in autoclave. Aggiungere 125 mL di 40% galattosio a dare 5 x soluzione di lievito peptone (YP) contenente 10% galattosio. Aggiungere, in un pallone da 250 mL, 0,04 g CSM-His, 0,335 g YNB + azoto e acqua a 47,5 mL. Sterilizzare in autoclave. Aggiungere 2,5 mL di glucosio 40% per ottenere 50 mL di CSM-His YNB + 2% di glucosio. Preparare 1 L di 1M Tris pH 7.0 con 121,14 g di Tris base con 800 mL di acqua. Fino a quando raggiunge il pH 7.0, aggiungere acido cloridrico concentrato. Aggiungere acqua ad un volume finale di 1L e passare attraverso un filtro da 0,2 µm. Preparare 500 mL di 0,5 M Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA), pH 8.0 73,06 g di EDTA con 400 mL di acqua. Aggiungere pellet di idrossido di sodio fino a quando l’EDTA ha dissolto e raggiunge il pH 8.0. Aggiungere acqua ad un volume finale di 500 mL e passare attraverso un filtro da 0,2 µm. Preparare 100 mL di fluoruro di fenilmetanosolfonil 100 mM (PMSF) 1,74 g di PMSF con etanolo prova 200. Conservare a-20 ° C. Preparare 225 mL di tampone di lavaggio perlina composto da Tris 50 mM a pH 7.0, NaCl 1,4 M, 20% glicerolo e 1 mM EDTA pH 8.0: 2x. Preparare 100 mL del buffer di cromatografia di esclusione di dimensione (S200 buffer) costituito da 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic acido idrato (MES) pH 6.5, NaCl 100 mM, 2% glicerolo e 0,03% n-dodecil-beta-D-Maltopyranoside (DDM). Preparare 100 mL di tampone di risospensione di membrana costituita da 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 500 mM NaCl e glicerolo al 10%. Preparare 10 mL di un 3 x tintura di caricamento SDS-PAGE con 3 mL 20% sodio dodecil solfato (SDS), glicerolo 3ml, 2,4 mL 1M Tris-HCl pH 6.8, 0,03 g di blu di bromofenolo e 1,6 mL 2-mercaptoetanolo. 2. la sovraespressione di borato Transporter in S. cerevisiae Inoculare tre colonie di lievito trasformato in 50 mL di CSM-His + YNB + 2% glucosio media e agitare durante la notte a 190 giri/min a 30 ° C. Il giorno seguente utilizzare uno spettrofotometro per determinare la densità ottica a una lunghezza d’onda di 600 nm (OD600) e inoculare un OD600 0,01 ogni quattro palloni tarati da 2 L, ciascuna delle quali contiene 500 mL di CSM-His YNB + + 2% glucosio media. Agitare a 190 giri/min a 30 ° C per 30 h per consentire alle cellule di consumare tutti i glucosio e crescere fino a un’alta densità.Nota: Un tempo più lungo di crescita rese risultati nella cella più grande, più grandi rendimenti del raccolto della membrana, e di proteina purificata in definitiva più grande. Inducono l’espressione aggiungere 125 mL di 5 supporti x YP completati con 10% galattosio per una concentrazione finale di induzione di 2% galattosio. Agitare a 190 giri/min a 30 ° C per 16 h. Cellule di raccolto di filatura a 4.000 x g per 15 min. Risospendere le cellule in 100 mL di acqua fredda.Nota: A questo punto le cellule possono essere congelate a-80 ° C a tempo indeterminato, o la preparazione può durare per tutta la lisi delle cellule e la membrana raccolta. Raccogliamo in genere 40-45 g di cellule. 3. raccolta delle membrane di lievito Aggiungere la risospensione delle cellule 11,25 mL di 1M Tris pH 7.0, 0,45 mL di EDTA 0.5 M e 2,25 mL di 100 mM PMSF, quest’ultimo due dei quali fungono da inibitori della proteasi. Aggiungere acqua fino ad un volume finale di 225 mL, che si traduce in un tampone di risospensione delle cellule di 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA e 1 mM PMSF.Nota: Se utilizzando congelati cellule consentono alle cellule di scongelare completamente, circa 1 ora a temperatura ambiente, perché se rimangono parzialmente congelati, essi resisteranno Lisi tramite la battitura del tallone. Aggiungere la risospensione delle cellule in un contenitore di metallo 450ml per bead battendo. Completano il volume residuo con perle di vetro freddo 0,5 mm. Montare una camera perlina-battendo con il rotore e immergere in un bagno di ghiaccio. Eseguire sei impulsi di 1 min, separati da periodi di riposo di 2 min per evitare il surriscaldamento del lisato. Assemblare un apparato di filtrazione sotto vuoto utilizzando una plastica usa e getta bottiglia superiore filtro avvitato in una bottiglia di vetro. Rimuovere la membrana di filtrazione, perché il dispositivo di plastica rimanente può catturare le perline consentendo lisato di passare. Separare le perle dal lisato versando il contenuto della camera di pestaggio del tallone sul gruppo durante l’applicazione del vuoto. Lavare la camera di pestaggio perlina con 225 mL di un tampone di lavaggio contenente 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1,4 M di NaCl e 20% glicerolo di 2x. Svuotare il contenuto della camera sulle perline per lavarli.Nota: Il lavaggio dà un volume finale di cellule ~ 450 mL lisati e significativamente aumenta raccolto membrana produce. Le concentrazioni finali sono 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10% glicerolo e 700 mM NaCl, e lo scopo primario di elevare la concentrazione di sale è quello di aiutare a dissociare le proteine di membrana periferici. Rotazione verso il basso la cella lysata per 15 min a 15.000 x g. Versare il supernatante in bottiglie in policarbonato e spin per 1 h a 135.000 x g in un’ultracentrifuga per raccogliere le membrane.Nota: Se non è disponibile un’ultracentrifuga, membrane possono essere raccolti da spinning per 3 h a 53.000 x g, una forza che è realizzabile in centrifughe di modello di piano. Scartare il surnatante e pesare le bottiglie con le palline di membrana. Risospendere il pellet di membrana in circa 35 mL membrana tampone di risospensione contenente 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl e 10% glicerolo e aggiungere un douncer di vetro. Pesare le provette da centrifuga vuoto per determinare la massa delle membrane raccolte.Nota: In un raccolto di membrana efficiente, il peso delle membrane sarà pari a circa il 20% il peso delle cellule utilizzato per tale raccolto di membrana. Questo protocollo dà rendimenti tipici delle cellule di 40-45 g, e quindi ci aspettiamo similarmente una resa delle membrane di 8-9 g. Lisata omogeneizzare le membrane e aliquota in provette coniche da 50 mL che ora possono essere conservate a tempo indeterminato a-80 ° C.Nota: Per questo esperimento, in genere due aliquote sono fatte, per consentire due purificazioni di proteina separato essere eseguita da una originale preparazione delle cellule. 4. solubilizzazione e purificazione della proteina In un recipiente aggiungere un ancoretta e 150 mg di n-dodecil-β-D-Maltopyranoside (DDM) a membrana g utilizzata. Tenere proteina sul ghiaccio o a 4 ° C in ogni momento.Nota: DDM è igroscopico e deve essere conservato in un barattolo di vetro con essiccante a-20 ° C quando non in uso. Inoltre, è tipico da utilizzare tra 4-5 g di membrane in una purificazione per ottenere una quantità apprezzabile di proteina pura. Scongelare le membrane e portare ad un volume finale di 15 mL / g membrana in tampone di risospensione di membrana completati con 1 mM PMSF e 20 mM imidazolo pH 8.0. Aggiungere il becher con DDM membrane e mescolare per 1 h a 4 ° C.Nota: La concentrazione di DDM sarà 1% w/v, ma per la solubilizzazione delle proteine di membrana che è più importante essere consapevoli della massa del detergente aggiunto a membrana g. Spin per 25 min a 135.000 x g a 4 ° C a pellet materiale non solubilizzato. Filtrare il surnatante attraverso un filtro per siringa 5 µm. Carico il campione dalla pompa peristaltica impostato con una portata di 1 mL/min su una colonna di affinità immobilizzata nichel 1ml equilibrato in 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% glicerolo, 20 mM imidazolo pH 8.0 e 0.05% DDM.Nota: Per le proteine che esprimono inferiore, rendimenti e purezza migliorata sono stati osservati utilizzando un 1 mL invece di 5ml colonna e nichel invece gli ioni cobalto per cromatografia di affinità. Lavare la colonna con 10 volumi di colonna di un tampone di lavaggio contenente 20 mM Tris-HCl pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% glicerolo, 80 mM imidazolo pH 8.0 e 0.05% DDM.Nota: La concentrazione di imidazolo che può essere utilizzata durante i lavaggi per una proteina 10-His-tag è superiore a quella comunemente è apprezzato e si traduce in una migliore purezza. Eluire la proteina nel buffer contenente 20 mM Tris-HCl pH 7.0, 200 mM NaCl, 10% glicerolo, 300 mM imidazolo pH 8.0 e 0.05% DDM. Raccogliere l’eluato in dieci frazioni di 1 mL e correre su un gel di Tris-glicina SDS-PAGE 4-20% insieme a frazioni di lisato e lavare solubilizzate. Frazioni di picco di piscina, di solito circa 5-6 mL e concentrato a 500 µ l o meno volume in un concentratore di cut-off di 50 kDa in una centrifuga da banco refrigerato a 4 ° C.Nota: 500 µ l è un tipico massimo volume iniettato in colonne cromatografiche (SEC) di dimensioni esclusione. A questo punto la proteina possono essere conservati a tempo indeterminato a-80 ° C oppure continuare sulla SEC. La proteina di filtrare attraverso un filtro di colonna spin 0,2 µm e iniettare su una colonna esclusione dimensioni (ad es., Superdex-200) equilibrata in tampone S200: 20mm Mes pH 6.5, NaCl 100 mM, 2% glicerolo e 0,03% DDM.Nota: Per la glutaraldeide successive analisi di cross-linking, agente tampone non deve contenere un’ammina primaria. SEC è un’occasione di scambio buffer se necessario, come fatto qui durante lo scambio di Tris per Mes. Eseguire che le frazioni di picco su una 4-20% Tris-glicina SDS-PAGE gel. Macchiare il gel, raccogliere le frazioni picco puro e concentrato in un concentratore di 50 kDa-taglio a 4 ° C. Determinare la concentrazione di proteina misurando l’assorbanza a una lunghezza d’onda di 280 nm e a tempo indeterminato a-80 ° C. 5. glutaraldeide cross-linking Assay Preparare una reazione µ l 10 con 3 µ l di proteina di 0,5 mg/mL in tampone S200, 5 µ l di tampone di S200, 1 µ l di acqua o 20% sodio dodecil solfato (SDS), seguita da 1 µ l di 1,5% glutaraldeide.Nota: Questo vi darà una reazione di 1 x di glutaraldeide proteina e 0,15% 0,15 mg/mL. Campioni contenenti un pre-trattamento di SDS sono importanti controlli negativi e dovrebbero essere misto e incubati a temperatura ambiente per 5 minuti prima di aggiungere la glutaraldeide. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Terminare la reazione aggiungendo 5 µ l di colorante, che contiene un eccesso di tampone Tris che estigue la glutaraldeide di caricamento del gel di SDS-PAGE: 3x. Caricare tutti i 15 µ l in gel di Tris-glicina SDS-PAGE 4-20%, che caricherà 1,5 µ g di proteine per corsia. Esegua il gel a 200 V per 30 min. macchia e determinare l’entità del dimero cross-linking da prove di una band che viene eseguito al doppio della dimensione del monomero denaturato.Nota: Una titolazione di glutaraldeide e il corso di tempo può essere eseguite in primo luogo per trovare le migliori condizioni per un trasportatore homomeric.