Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

1. Vorbereitung von Medien und wichtige Puffer Bereiten Sie durch Zugabe von 200 g Galaktose und deionisiertes Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 mL 500 mL 40 % Galaktose vor. Verwenden Sie eine heiße Platte oder in der Mikrowelle zu einer erhöhten Rate von Galaktose in Lösung. Sterilfilter mit einem Vakuumfiltration Apparat, bestehend aus einen 0,2 µm Filter oben mit einer sterilen Glasflasche verbunden.Hinweis: Alle Medien-Lösungen werden mit deionisiertes Wasser zubereitet. Bereiten Sie durch Zugabe von 200 g Glucose und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 500 mL 500 mL 40 % Glukose vor. Autoklav zu sterilisieren. Zugeben Sie in jedem der vier 2 L Flaschen 0,4 g komplette Ergänzung Mischung ohne Histidin (CSM-HSI), 3,35 g Hefe Stickstoff mit Ammoniumsulfat (YNB + Stickstoff) und 475 mL Wasser. Autoklaven. Fügen Sie 25 mL 40 % Glukose, eine endgültige Glukosekonzentration von 2 % zu erreichen. Hinzufügen einer Glasflasche, 50 g Pepton und 25 g Hefeextrakt und 375 mL Wasser. Autoklaven. Hinzugeben Sie 125 mL 40 % Galaktose zu geben 5 x Hefe Pepton (YP) Lösung mit 10 % Galaktose. Hinzufügen, um eine 250 mL Flasche 0,04 g CSM-HSI, 0,335 g YNB + Stickstoff und Wasser bis 47,5 mL. Autoklaven. Fügen Sie 2,5 mL 40 % Glukose zu 50 mL der CSM-HSI + YNB + 2 % Glukose. Bereiten Sie 1 L 1M Tris pH 7.0 121,14 g Tris Basis mit 800 mL Wasser vermischen. Fügen Sie konzentrierten Salzsäure hinzu, bis der pH-Wert 7,0 erreicht. Ein finales Volumen von 1 L Wasser hinzufügen und einen 0,2 µm-Filter durchlaufen. Bereiten Sie 500 mL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) pH 8.0 73,06 g EDTA mit 400 mL Wasser vermischen. Hinzufügen von Natriumhydroxid Pellets bis EDTA aufgelöst hat und der pH-Wert 8.0 erreicht. Ein finales Volumen von 500 mL Wasser hinzufügen und einen 0,2 µm-Filter durchlaufen. Bereiten Sie 100 mL 100 mM Phenylmethanesulfonyl Fluorid (PMSF vor) durch das Mischen von 1,74 g PMSF mit 200 Beweis Ethanol. Shop bei-20 ° C. Bereiten Sie 225 mL 2 x Perle Waschpuffer bestehend aus 50 mM Tris pH 7,0, 1,4 M NaCl, 20 % Glycerin und 1 mM EDTA pH 8.0 vor. Bereiten Sie 100 mL Puffer Größe Ausgrenzung Chromatographie (S200 Puffer) bestehend aus 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic Säure-Hydrat (MES) pH 6,5, 100 mM NaCl, 2 % Glycerin und 0,03 % n-Dodecyl-Beta-D-Maltopyranoside (DDM vor). Bereiten Sie 100 mL Membran Wiederfreisetzung Puffer bestehend aus 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, und 10 % Glycerin. Bereiten Sie 10 mL eines 3 x SDS-PAGE laden Farbstoff durch Mischen von 3 mL 20 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), 3 mL Glycerin, 2,4 mL 1M Tris pH 6.8, 0,03 g Bromophenol Blue und 1,6 mL 2-Mercaptoethanol vor. 2. die Überexpression von Borat-Transporter in S. cerevisiae Impfen drei transformierte Hefe Kolonien in 50 mL CSM-HSI + YNB + 2 % Glukose Medien und schütteln über Nacht bei 190 u/min bei 30 ° C. Am nächsten Tag ein Spektralphotometer verwenden, um festzustellen, die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600) und auf einer OD600 0,01 vier 2 L Flaschen, die jeweils 500 mL CSM-HSI enthalten impfen + YNB + 2 % Glukose Medien. Schütteln Sie bei 190 u/min bei 30 ° C für 30 h erlauben die Zellen verbrauchen alle Glukose und wachsen, um eine hohe Dichte.Hinweis: Eine längere Wachstumszeit Ergebnisse in größeren Zelle ergibt, größere geernteten Membran Erträge und letztlich größeres gereinigtes Protein ergibt. Ausdruck durch Zugabe von 125 mL 5 X YP Medien ergänzt mit 10 % Galaktose für eine endgültige Induktion-Konzentration von 2 % Galaktose zu induzieren. Schütteln Sie bei 190 u/min bei 30 ° C 16 h. Ernte-Zellen durch Spinnen bei 4.000 X g für 15 min. Aufschwemmen der Zellen in 100 mL kaltem Wasser.Hinweis: an dieser Stelle Zellen können eingefroren werden bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit oder die Vorbereitung kann in Zelle Lysis und Membran Ernte weiter. Wir ernten in der Regel 40-45 g Zellen. 3. Gewinnung von Hefe Membranen Hinzu kommt die Zelle Wiederfreisetzung 11,25 mL 1M Tris pH 7,0, 0,45 mL 0,5 M EDTA und 2,25 mL 100 mm PMSF, Letzteres, von denen zwei als Protease-Inhibitoren wirken. Fügen Sie Wasser zu einem Endvolumen von 225 mL, die Ergebnisse in eine Zelle Wiederfreisetzung Puffer von 50 mM Tris pH 7,0, EDTA, 1 mM und 1 mM PMSF hinzu.Hinweis: Wenn mit gefrorenen Zellen Zellen gründlich, ca. 1 h bei Raumtemperatur auftauen lassen, weil wenn sie teilweise eingefroren bleiben, lyse durch Wulst schlagen widerstehen wird. Fügen Sie die Zelle Wiederfreisetzung in einen 450 mL Metall-Kanister für Bead schlagen. Krönen Sie das restliche Volumen mit kalten 0,5 mm Glasperlen. Eine Perle-Prügel-Kammer mit dem Rotor montieren und Tauchen in ein Eisbad. Führen Sie sechs 1 min Impulsen, getrennt durch 2 min Ruhezeiten der lysate Überhitzen zu vermeiden. Montieren Sie einen Vakuumfiltration Apparat, indem mit einem Kunststoff Einweg Flasche Top Filter geschraubt in einer Glasflasche. Die Filtration Membran zu entfernen, da die verbleibenden Kunststoff Gerät die Perlen erfasst werden kann, wobei lysate übergeben. Trennen Sie die Perlen von der lysate Gießen Sie den Inhalt der Wulst schlagen Kammer auf die Assembly beim Anlegen des Vakuums. Waschen Sie die Wulst schlagen Kammer mit 225 mL eines 2 x Waschpuffer, die 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1,4 M NaCl und 20 % Glycerin enthält. Leeren Sie den Inhalt der Kammer auf die Perlen zu waschen.Hinweis: Die Wäsche gibt einem Endvolumen von ~ 450 mL lysiert Zellen und deutlich erhöht geernteten Membran ergibt. Die Endkonzentrationen sind 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 % Glycerin und 700 mM NaCl, und der primäre Zweck der Erhöhung der Salzkonzentration soll helfen, periphere Membranproteine distanzieren. Spin-down der Zelle lysate für 15 min bei 15.000 X g. Gießen Sie den Überstand in Polycarbonat-Flaschen und Spin für 1 h bei 135.000 X g in einer Ultrazentrifuge Membranen zu sammeln.Hinweis: Wenn eine Ultrazentrifuge nicht verfügbar ist, können Membranen von Spinnen für 3 h bei 53.000 X g, eine Kraft gesammelt werden, die im Boden Modell Zentrifugen erreicht werden kann. Verwerfen Sie den Überstand und wiegen Sie die Flaschen mit dem Membran-Pellets. Die Membran-Pellets in etwa 35 mL Membran Wiederfreisetzung Puffer mit 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, und 10 % Glycerin Aufschwemmen und ein Glas Douncer hinzufügen. Wiegen Sie die leere Zentrifuge Röhren um die Masse der Membranen geerntet zu bestimmen.Hinweis: In eine effiziente Membran-Ernte, das Gewicht der Membranen entspricht etwa 20 % wird das Gewicht der Zellen für die Membran-Ernte verwendet. Dieses Protokoll gibt typische Zelle Ertrag von 40-45 g, und so erwarten wir ebenfalls eine Rendite von 8-9 g Membranen. Dounce Homogenisieren der Membranen und Aliquot in 50 mL konische Röhrchen, die nun auf unbestimmte Zeit bei-80 ° c gespeichert werden kannHinweis: Für dieses Experiment sind in der Regel zwei Aliquote gemacht, erlauben zwei separate Protein-Reinigungen von einem ursprünglichen Zelle Vorbereitung durchgeführt werden. (4) Solubilization und Reinigung des Proteins Ein Becherglas fügen Sie hinzu, rühren Bar und 150 mg n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) pro g Membran verwendet wird. Seien Sie stets Protein auf dem Eis oder bei 4 ° C.Hinweis: DDM ist hygroskopisch und sollte in ein Glas mit Trockenmittel bei-20 ° C Wenn nicht in Gebrauch gespeichert werden. Darüber hinaus ist es üblich, zwischen 4 – 5 g der Membranen in eine Reinigung, eine nennenswerte Menge an reines Protein zu erhalten zu verwenden. Auftauen von Membranen und bringen zu einem Endvolumen von 15 mL pro g Membran Membran Wiederfreisetzung Puffer mit 1 mM PMSF und 20 mM Imidazol pH 8.0 ergänzt. Das Becherglas mit DDM Membranen hinzu und rühren Sie für 1 h bei 4 ° C.Hinweis: Die DDM-Konzentration werden 1 % w/V, aber es ist für die Solubilisierung von Membranproteinen kritischer bewusst von der Masse der Reinigungsmittel pro g Membran hinzugefügt werden. Spinnen Sie für 25 min bei 135.000 X g bei 4 ° C zu Pellets nicht solubilisiert Material. Filtern Sie den Überstand durch eine 5 µm-Spritze-Filter. Lastsatz die Probe durch die peristaltischen Pumpe für einen Durchfluss von 1 mL/min auf eine 1 mL immobilisierten Nickel Affinität Säule equilibriert in 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, 10 % Glycerin, 20 mM Imidazol pH 8.0 und 0,05 % DDM.Hinweis: Für die unteren mit dem Ausdruck ihrer Proteine, verbesserte Reinheit und Erträge beobachtet mit 1 mL statt 5 mL Spalte und Nickel anstelle von Kobalt-Ionen für die Affinitätschromatographie. Waschen Sie die Spalte mit 10 Spalte Bände einer Waschpuffer mit 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, 10 % Glycerin, 80 mM Imidazol pH 8.0 und 0,05 % DDM.Hinweis: Die Imidazol-Konzentration, die für ein 10-sein-tagged Proteins während Waschungen verwendet werden kann ist höher als allgemein geschätzt und zu verbesserten Reinheit führt. Das Protein in den Puffer mit 20 mM Tris pH 7,0, 200 mM NaCl, 10 % Glycerin, 300 mM Imidazol pH 8.0 und 0,05 % eluieren DDM. Sammeln Sie das Eluat in zehn 1 mL Fraktionen zu und führen Sie auf einem 4-20 % Tris-Glycin SDS-PAGE Gel zusammen mit solubilisiert lysate und waschen-Fraktionen. Pool Gipfel Brüche, in der Regel etwa 5-6 mL und konzentrieren sich auf 500 µL oder weniger Volumen in einem 50 kDa cutoff Konzentrator in einer Benchtop-Zentrifuge bei 4 ° c gekühltHinweis: 500 µL ist eine typische maximale Größe Ausgrenzung Chromatographiesäulen (SEC) injiziert. An dieser Stelle das Protein kann auf unbestimmte Zeit bei-80 ° C gelagert werden oder fahren Sie auf die Sek. Das Protein durch einen 0,2 µm Spin Spaltenfilter filtern und Spritzen auf eine Spalte “Größe Ausgrenzung” (z. B. Superdex-200) in S200 Puffer equilibriert: 20 mM Mes pH 6,5, 100 mM NaCl, 2 % Glycerin und 0,03 % DDM.Hinweis: Für die nachfolgenden Glutaraldehyd Vernetzung Assay, muss der Pufferung Agent kein primäres Amin enthalten. SEC ist eine Gelegenheit, Puffer, falls erforderlich, austauschen, wie hier geschehen, beim Austausch von Tris für Mes. Führen Sie die Spitze Fraktionen auf ein 4-20 % Tris-Glycin SDS-PAGE gel. Fleck das Gel, pure Spitze Brüche zu sammeln und konzentrieren sich in einem 50 kDa-Cutoff-Konzentrator bei 4 ° c Konzentration des Proteins zu bestimmen, durch Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 280 nm und Shop auf unbestimmte Zeit bei-80 ° C. 5. Vernetzung Assay Glutaraldehyd Vorbereiten einer 10 µL Reaktion durch das Mischen von 3 µL 0,5 mg/mL Protein in S200 Puffer, 5 µL S200 Puffer, 1 µL entweder Wasser oder 20 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), gefolgt von 1 µL 1,5 % Glutaraldehyd.Hinweis: Dies wird eine 1 X Reaktion von 0,15 mg/mL Protein und 0,15 % Glutaraldehyd geben. Proben, die eine Vorbehandlung der SDS werden sind wichtige Negativkontrollen und gemischt und bei Raumtemperatur für 5 min vor dem Hinzufügen von Glutaraldehyd inkubiert. Inkubieren Sie die Reaktion für 30 min bei Raumtemperatur. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 5µL 3 x SDS-PAGE Gel laden Farbstoff, der ein Übermaß an Tris-Puffer enthält, die das Glutaraldehyd stillt. Laden Sie alle 15 µL auf 4-20 % Tris-Glycin SDS-PAGE Gel, das 1,5 µg Protein pro Bahn geladen wird. Führen Sie das Gel bei 200 V für 30 min. Fleck und bestimmen Sie das Ausmaß der Dimer Vernetzung durch Beweise für eine Band, die mit doppelt so groß wie das denaturierte Monomer ausgeführt wird.Hinweis: Eine Glutaraldehyd Titration und zeitlichen Verlauf können zuerst durchgeführt, um die besten Voraussetzungen für eine Homomeric-Transporter finden.