Expression, solubilisation et Purification des transporteurs de Borate eucaryotes

1. préparation des supports et tampons importants Préparer 500 mL de galactose de 40 % en ajoutant 200 g de galactose et de l’eau déminéralisée pour un volume total de 500 mL. Utiliser une plaque chauffante ou four à micro-ondes pour augmenter le taux de galactose dans la solution. Filtres stériles avec un appareil de filtration sous vide, consistant en un haut filtre de 0,2 µm attaché à une bouteille de verre stériles.Remarque : Toutes les solutions de médias sont préparées à l’aide de l’eau déminéralisée. Préparer 500 mL de glucose 40 % en ajoutant 200 g de glucose et d’eau pour un volume total de 500 mL. Autoclave pour stériliser. Dans chacune des quatre fioles 2 L, ajouter 0,4 g de mélange de complément complet sans histidine (CSM-His), 3,35 g levure azote base avec le sulfate d’ammonium (YNB + azote) et 475 mL d’eau. Autoclave. Ajouter 25 mL de glucose 40 % pour atteindre une concentration de glucose finale de 2 %. Ajouter, à une bouteille en verre, peptone de 50 g et 25 g de levure, extrait et à 375 mL d’eau. Autoclave. Ajouter 125 mL de galactose de 40 % de donner 5 x solution de peptone (YP) levure contenant 10 % de galactose. Ajouter, dans une fiole jaugée de 250 mL, 0,04 g CSM-His, 0,335 g YNB + azote et eau à 47,5 mL. Autoclave. Ajouter 2,5 mL de glucose 40 % d’obtenir 50 mL de CSM-His YNB + 2 % de glucose. Préparer 1 L de 1M Tris pH 7.0 en mélangeant 121,14 g de Tris base avec 800 mL d’eau. Ajouter l’acide chlorhydrique concentré jusqu’à pH 7.0. Ajouter de l’eau pour un volume final de 1 L et passer par un filtre de 0,2 µm. Préparer 500 mL de 0,5 M EDTA acide (EDTA) pH 8,0 en mélangeant 73,06 g d’EDTA avec 400 mL d’eau. Ajouter les pastilles d’hydroxyde de sodium jusqu’à ce que l’EDTA a dissous et le pH atteint 8.0. Ajouter de l’eau pour un volume final de 500 mL et passer par un filtre de 0,2 µm. Préparer 100 mL de fluorure de phénylméthanesulfonyle de 100 mM (PMSF) en mélangeant 1,74 g de PMSF à 200 éthanol preuve. Conserver à-20 ° C. Préparer les 225 mL de 2 x tampon de lavage perle comprenant 50 mM Tris pH 7.0, 1,4 M NaCl, 20 % de glycérol et 1 mM EDTA pH 8.0. Préparation de 100 mL de la taille de tampon de chromatographie d’exclusion (tampon S200) consistant en 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic acide hydrate (MES) pH 6.5, 100 mM NaCl, glycérol 2 % et 0,03 % n-dodécyl-bêta-D-Maltopyranoside (DDM). Préparer 100 mL de tampon de resuspension de membrane composée de 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl et de 10 % de glycérol. Préparer 10 mL d’un 3 x colorant de chargement de SDS-PAGE en mélangeant 3 mL 20 % dodécylsulfate de sodium (SDS), 3 mL de glycérol, 2,4 mL 1M Tris pH 6,8, 0,03 g de bleu de bromophénol et 1,6 mL 2-mercaptoéthanol. 2. la surexpression du transporteur de Borate chez S. cerevisiae Inoculer les trois colonies de levure transformée dans 50 mL de CSM-His + YNB + support de 2 % de glucose et agiter pendant la nuit à 190 tr/mn à 30 ° C. Le lendemain utilisez un spectrophotomètre pour déterminer la densité optique à une longueur d’onde de 600 nm (OD600) et ensemencer à une OD600 de 0,01 chacune de quatre flacons de 2 L qui contiennent chacun 500 mL de CSM-His YNB + 2 % médias de glucose. Agiter à 190 tr/mn à 30 ° C pendant 30 h permettre les cellules à consommer tous les glucose et atteindre une densité élevée.NOTE : Un temps plus long de la croissance des résultats dans une cellule plus grande donne, plus grands rendements membrane récoltés, et finalement plus grande protéine purifiée donne. Induisent l’expression en ajoutant 125 mL de 5 supports de x YP additionné de galactose de 10 % pour une concentration finale de l’induction du galactose de 2 %. Agiter à 190 tr/mn à 30 ° C pendant 16 h. Récolte des cellules de la filature à 4 000 x g pendant 15 min. remettre en suspension les cellules dans 100 mL d’eau froide.Remarque : À ce stade les cellules peuvent être congelés à-80 ° C indéfiniment, ou continue la préparation dans la lyse des cellules et la membrane de récolte. Nous récoltons généralement 40-45 g de cellules. 3. récolte des Membranes de levure Ajouter à la resuspension de cellule 11,25 mL de 1M Tris pH 7.0, 0,45 mL d’EDTA 0,5 M et 2,25 mL de 100 mM PMSF, ce dernier, dont deux agissent comme inhibiteurs de la protéase. Ajouter de l’eau pour un volume final de 225 mL, ce qui se traduit par un tampon de resuspension de cellule de PMSF à 50 mM Tris pH 7.0, EDTA, 1 mM et 1 mM.Remarque : Si vous utilisez des congelés de cellules permettre cellules de décongeler complètement, environ 1 h à température ambiante, parce que s’ils restent partiellement gelés, ils résisteront lyse par coups de talon. Ajouter la remise en suspension des cellules dans un bidon métal 450 mL pour perle battant. Terminez le volume restant avec perles de verre froid 0,5 mm. Permet d’assembler une chambre perle-battant avec le rotor et plonger dans un bain de glace. Effectuer six impulsions de 1 min, séparées par des périodes de repos de 2 min pour éviter la surchauffe du lysat. Assembler un appareil de filtration sous vide à l’aide d’un plastique jetables bouteille filtre supérieur vissé dans une bouteille en verre. Enlever la membrane de filtration, parce que l’appareil reste en plastique peut capturer les perles tout en permettant un lysat de passer. Séparer les perles le lysat en versant le contenu de la chambre de coups de talon sur l’assemblage tout en appliquant le vide. Laver la chambre perle de battement 225 ml d’un 2 x tampon de lavage qui contient 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, PMSF 1 mM, 1,4 M de NaCl et 20 % de glycérol. Vider le contenu de la chambre sur les perles de la laver.Remarque : Le lavage donne un volume final de cellules ~ 450 mL lysée et significativement les rendements hausses récoltées membrane. Les concentrations finales sont 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, PMSF 1 mM, 10 % de glycérol et de 700 mM NaCl, et l’objectif principal de l’élévation de la concentration en sel est d’aider à dissocier les protéines membranaires périphériques. Tourner vers le bas de la cellule lysate à 15 000 x gpendant 15 minutes. Versez le liquide surnageant dans des bouteilles en polycarbonate et un essorage pendant 1 h à 135 000 x g dans une ultracentrifugeuse pour recueillir des membranes.Remarque : Si une ultracentrifugeuse n’est pas disponible, les membranes peuvent être recueillies par rotation pendant 3 h à 53 000 x g, une force qui est réalisable dans les centrifugeuses modèle de plancher. Jeter le surnageant et peser les bouteilles avec des granulés de membrane. Remettre en suspension les pellets de membrane dans environ 35 mL membrane resuspension tampon contenant 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl et 10 % de glycérol et ajouter à un verre de douncer. Peser les tubes à centrifuger vide pour déterminer la masse des membranes récoltés.Remarque : Une récolte de membrane efficace, le poids des membranes sera égal à environ 20 % le poids des cellules utilisé pour la récolte de cette membrane. Ce protocole donne des rendements de cellule typique de 40-45 g, et nous attendons donc de même un rendement de membranes de 8-9 g. Dounce homogénéiser les membranes et la partie aliquote dans des tubes de 50 mL conique qui peuvent désormais être conservés indéfiniment à-80 ° C.Remarque : Pour cette expérience, en général deux parties aliquotes sont faites, afin de permettre des purifications de protéines distinctes deux à être exécutée à partir d’une préparation de cellules originales. 4. solubilisation et Purification de protéine Dans un bécher, ajouter une barre de remuer et 150 mg de n-dodécyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) par membrane g utilisé. Garder les protéines sur la glace ou à 4 ° C en permanence.NOTE : DDM est hygroscopique et doit être conservé dans un bocal en verre avec déshydratant à-20 ° C quand pas en service. En outre, il est typique d’utiliser entre 4 à 5 g de membranes en une purification pour obtenir une quantité appréciable de protéines pures. Décongeler les membranes et les porter à un volume final de 15 mL par g membrane dans le tampon de resuspension de membrane additionné de PMSF à 1 mM et 20 mM imidazole pH 8.0. Ajouter des membranes dans le bécher avec DDM et remuer pendant 1 h à 4 ° C.Remarque : La concentration de la DDM sera 1 % p/v, mais pour la solubilisation des protéines de la membrane, il est plus essentiel d’être conscient de la masse du détergent ajoutée par membrane g. Tournez pendant 25 min à 135 000 x g à 4 ° C pour granuler matériel non solubilisées. Filtrer le liquide surnageant à travers un filtre de seringue de 5 µm. Charge l’échantillon par la pompe péristaltique, réglé à un débit de 1 mL/min sur une colonne d’affinité de nickel immobilisée 1 mL équilibrées dans 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10 % de glycérol, 20 mM imidazole pH 8,0 et 0.05 % DDM.NOTE : Pour les protéines exprimant inférieurs, rendements et pureté améliorée ont été observés en utilisant un 1 mL au lieu de colonne de 5 mL et nickel au lieu d’ions cobalt pour la chromatographie d’affinité. Laver la colonne avec 10 volumes de colonne d’un tampon de lavage contenant 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10 % de glycérol, 80 mM imidazole pH 8,0 et 0.05 % DDM.Remarque : La concentration de l’imidazole qui peut être utilisée au cours de lavages pour une protéine 10-His-tag est supérieure à est généralement apprécié et se traduit par une pureté améliorée. Éluer la protéine dans la mémoire tampon contenant 20 mM Tris pH 7.0, 200 mM NaCl, 10 % de glycérol, 300 mM imidazole pH 8,0 et 0.05 % DDM. Recueillir l’éluat dans dix fractions de 1 mL et fonctionner sur un gel de Tris-glycine SDS-PAGE 4-20 % avec fractions solubilisés de lysats et laver. Fractions de pic de piscine, habituellement d’environ 5 à 6 mL et concentré à 500 µL ou moins volume dans un concentrateur de coupure de 50 kDa dans une centrifugeuse de paillasse au réfrigérateur à 4 ° C.NOTE : 500 µL est un volume maximal typique injecté dans les colonnes de chromatographie (SEC) taille exclusion. À ce stade la protéine peuvent être conservés indéfiniment à-80 ° C ou continuer sur SEC. La protéine filtrer sur un filtre de colonne de spin de 0,2 µm et injecter sur une exclusion colonne taille (p. ex., Superdex-200) s’équilibrée dans un tampon S200 : 20 mM Mes pH 6.5, 100 mM NaCl, glycérol 2 % et 0,03 % DDM.Remarque : Pour le glutaraldéhyde ultérieur réticulation dosage, l’agent de mise en mémoire tampon ne doit pas contenir une amine primaire. S est l’occasion d’échanger des tampons si nécessaire, comme fait ici lors de l’échange des Tris pour Mes. Exécuter que les fractions de pointe dans un 4-20 % Tris-glycine SDS-PAGE de gel. Souillez le gel, recueillir des fractions de pic pur et concentré dans un concentrateur de 50 kDa coupure à 4 ° C. Déterminer la concentration de protéine en mesurant l’absorbance à une longueur d’onde de 280 nm et les conserver indéfiniment à-80 ° C. 5. glutaraldéhyde réticulation Assay Préparer une réaction µL 10 en mélangeant 3 µL de protéine de 0,5 mg/mL dans un tampon S200 5 µL de tampon de S200, 1 µL de l’eau, ou 20 % dodécylsulfate de sodium (SDS), suivie de 1 µL de glutaraldéhyde à 1,5 %.Remarque : Cela vous donnera une réaction 1 x de glutaraldéhyde protéines et 0,15 % de 0,15 mg/mL. Échantillons contenant un pré-traitement de la SDD sont témoins négatifs importants et devraient être mélangés et incubés à température ambiante pendant 5 min avant d’ajouter le glutaraldéhyde. Incubez la réaction pendant 30 min à température ambiante. Mettre fin à la réaction en ajoutant 5 µl de 3 x gel SDS-PAGE chargement colorant, qui contient un excès de tampon Tris qui désaltère le glutaraldéhyde. Charger tous les 15 µL sur gel de Tris-glycine SDS-PAGE 4-20 %, qui se charge de 1,5 µg de protéines par voie. Exécutez le gel à 200 V pendant 30 min. tache et déterminer le degré de réticulation de dimère de preuves d’une bande qui s’exécute à deux fois la taille du monomère dénaturé.Nota : Un titrage de glutaraldéhyde et le décours temporel peuvent être effectuées tout d’abord pour trouver les meilleures conditions pour un transporteur homomères.