Meningsuiting, solubilisatie en zuivering van eukaryotische boraat Transporters

1. voorbereiding van de media en belangrijke buffers Bereiden 500 mL 40% galactose door 200 g galactose en -geïoniseerd water toe te voegen aan een totaal volume van 500 mL. Gebruik een hete plaat of magnetron te verhogen van het tempo van de galactose krijgen in oplossing. Steriel filter met een vacuüm filtratie apparaat bestaande uit een 0,2 µm filter top gekoppeld aan een steriele fles.Opmerking: Alle mediaoplossingen zijn bereid met behulp van de geïoniseerd water. Bereiden 500 mL van 40% glucose door 200 g glucose en water toe te voegen aan een totaal volume van 500 mL. Autoclaaf te steriliseren. In elk van de vier 2 L kolven, Voeg 0.4 g van volledige aanvulling mengsel zonder histidine (CSM-Hsi), 3,35 g gist stikstof basis met ammoniumsulfaat (YNB + stikstof) en 475 mL water. Autoclaaf. Voeg 25 mL van 40% glucose te bereiken van een definitieve glucose concentratie van 2%. Toevoegen, een glazen fles, 50 g pepton en 25 g gistextract en tot 375 mL water. Autoclaaf. Voeg 125 mL 40% galactose te geven van 5 x Gist-pepton (YP) oplossing met 10% galactose. Toevoegen, in een maatkolf van 250 mL, 0,04 g CSM-Hsi, 0.335 g YNB + stikstof en water tot 47.5 mL. Autoclaaf. Voeg 2,5 mL van 40% glucose om 50 mL van CSM-Hsi YNB + 2% glucose. Bereid 1 L van 1M Tris pH 7.0 door het mengen van 121.14 g van Tris basis met 800 mL water. Geconcentreerd zoutzuur toevoegen totdat de pH 7.0. Voeg water toe tot een eindvolume van 1 L en passeren een 0,2 µm filter. Bereid 500 mL 0,5 M ethyleendiamminetetra zuur (EDTA) pH 8,0 door het mengen van 73.06 g EDTA met 400 mL water. Natriumhydroxide-pellets toevoegen totdat het EDTA is ontbonden en de pH 8.0 bereikt. Voeg water toe tot een eindvolume van 500 mL en passeren een 0,2 µm filter. Bereid 100 mL voor 100 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) door het mengen van 1.74 g PMSF met 200 bewijs ethanol. Winkel bij-20 ° C. 225 mL 2 x parel was buffer bestaande uit 50 mM Tris pH 7.0, 1.4 M NaCl, 20% glycerol en 1 mM EDTA pH 8.0 voor te bereiden. 100 mL van de uitsluiting chromatografie buffergrootte (S200 buffer) bestaande uit 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic zuur hydraat (MES) pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glycerol en 0,03% n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) voor te bereiden. 100 mL membraan resuspensie buffer bestaande uit 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, en 10% glycerol te bereiden. 10 mL van een 3 x SDS-pagina laden kleurstof voor te bereiden door het mengen van 3 mL 20% natrium dodecyl sulfaat (SDS), 3 mL glycerol, 2.4 mL 1M Tris pH 6.8, 0,03 g bromophenol blauw en 1.6 mL 2-mercaptoethanol. 2. overexpressie van boraat Transporter in S. cerevisiae Inoculeer drie getransformeerde gist kolonies in 50 mL CSM-Hsi + YNB + 2% glucose media en schud overnachting in 190 rpm bij 30 ° C. De volgende dag een spectrofotometer gebruiken om te bepalen van de optische dichtheid bij een golflengte van 600 nm (OD600) en beënten tot een OD600 van 0,01 elk van vier 2 L kolven bevatten elk 500 mL van CSM-Hsi YNB + 2% glucose media. Schudden van 190 toeren per minuut bij 30 ° C gedurende 30 h om de cellen te verbruiken alle glucose en te groeien naar een hoge dichtheid toestaan.Opmerking: Resulteert in een langere tijd van groei resulteert in grotere cel, grotere geoogste membraan opbrengsten, en uiteindelijk grotere gezuiverde eiwit levert. Induceren expressie door toevoeging van 125 mL 5 x YP media aangevuld met 10% galactose voor een inductie van de definitieve concentratie van 2% galactose. Schudden van 190 toeren per minuut bij 30 ° C gedurende 16 h. Oogst cellen door spinnen bij 4000 x g gedurende 15 min. resuspendeer de cellen in 100 mL koud water.Opmerking: op dit punt cellen kunnen worden bevroren bij-80 ° C voor onbepaalde tijd, of de prep in lysis van de cel en membraan oogsten kan worden voortgezet. We oogsten meestal 40-45 g van cellen. 3. oogsten van gist membranen Toevoegen aan de cel resuspensie 11.25 mL 1M Tris pH 7.0, 0,45 milliliters EDTA 0.5 M, en 2,25 mL van 100 mM PMSF, de laatste twee van die als proteaseinhibitors fungeren. Voeg water toe tot een eindvolume van 225 mL, wat in een resuspensie van de cel buffer van 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, en 1 mM PMSF resulteert.Opmerking: Als met behulp van bevroren cellen toestaan cellen te ontdooien grondig, ongeveer 1 uur bij kamertemperatuur, omdat als ze gedeeltelijk bevroren blijven, zij lysis zal weerstaan door kraal gewonnen. Voeg de cel hersuspensie in een metalen busje van 450 mL voor kraal gewonnen. Top af met koude 0.5 mm glaskralen het resterende volume. Monteren van een kraal-kloppend kamer met de rotor en onderdompelen in een ijsbad. Uitvoeren van zes 1 min pulsen, gescheiden door 2 minuten rusttijden de lysate oververhitting te voorkomen. Monteren van een vacuüm filtratie-apparatuur met behulp van een plastic wegwerp fles top filter geschroefd in een glazen fles. Verwijder het membraan van de filtratie, omdat de resterende kunststof apparaat de kralen vangt kan terwijl lysate geschiedde. De parels van de lysate scheiden door het gieten van de inhoud van de meetkamer kloppend kraal op de vergadering tijdens het toepassen van het vacuüm. Wassen van de kraal kloppend kamer met een 2 x wassen buffer waarin 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1.4 M NaCl, en 20% glycerol 225 mL. Verwijder de inhoud van de kamer op de parels om ze te wassen.Opmerking: De wash geeft een eindvolume van ~ 450 mL lysed cellen en aanzienlijk verhoogt geoogste membraan levert. De eindconcentraties zijn 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10% glycerol en 700 mM NaCl en het primaire doel van het verheffen van de zoutconcentratie is te distantiëren van perifere membraaneiwitten. Spin down de cel lysate gedurende 15 minuten staan bij 15.000 x g. Giet het supernatant in polycarbonaat flessen en spin voor 1 h bij 135.000 x g in een ultracentrifuge voor het verzamelen van membranen.Opmerking: Als een ultracentrifuge niet beschikbaar is, membranen kunnen worden verzameld door spinnen gedurende 3 uur bij 53.000 x g, een kracht die in de vloer model centrifuges haalbaar is. Verwijder het supernatant en wegen van de flessen met de membraan-pellets. Resuspendeer de membraan-pellets in ongeveer 35 mL membraan resuspensie buffer met 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, en 10% glycerol en voeg toe aan een glas douncer. Weeg de lege centrifuge buizen om te bepalen van de massa van membranen geoogst.Opmerking: In de oogst van een efficiënte membraan, het gewicht van membranen worden gelijk aan ongeveer 20% het gewicht van cellen voor die oogst membraan gebruikt. Dit protocol geeft typische cel opbrengsten van 40-45 g, en dus verwachten we ook een rendement van 8-9 g membranen. Dounce Meng de membranen en aliquot in 50 mL conische buizen die nu voor onbepaalde tijd kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C.Opmerking: Voor dit experiment, meestal twee aliquots zijn gemaakt, zodat twee aparte eiwit zuivering worden uitgevoerd vanaf de ene oorspronkelijke cel voorbereiding. 4. solubilisatie en zuivering van eiwitten Voeg een roer bar en 150 mg n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) per g membraan wordt gebruikt in een bekerglas. Eiwit op het ijs of bij 4 ° C houden te allen tijde.Opmerking: DDM hygroscopisch is en in een glazen pot met droogmiddel bij-20 ° C wanneer niet in gebruik moet worden opgeslagen. Het is ook typisch tussen de 4-5 g van membranen in een zuivering te verkrijgen van een aanzienlijke hoeveelheid pure eiwit te gebruiken. Ontdooi membranen en een eindvolume van 15 mL per g membraan in membraan resuspensie buffer aangevuld met 1 mM PMSF en 20 mM imidazool pH 8,0 brengen. Membranen toevoegen aan het bekerglas af met DDM en roer gedurende 1 uur bij 4 ° C.Opmerking: De DDM concentratie worden 1% w/v, maar voor de solubilisatie van membraaneiwitten wel kritischer bewust te zijn van de hoeveelheid wasmiddel toegevoegd per g membraan. Spin voor 25 min bij 135.000 x g bij 4 ° C tot niet-ontbindend materiaal pellet. De bovendrijvende vloeistof filteren door een filter van de spuit 5 µm. Belasting de Voorbeeldset door de peristaltische pomp met een debiet van 1 mL/min op een 1 mL geïmmobiliseerdet nikkel affiniteit kolom geëquilibreerd in 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 20 mM imidazool pH 8,0 en 0,05% DDM.Opmerking: Voor lagere waarin eiwitten, verbeterde zuiverheid en de opbrengsten werden waargenomen met behulp van een 1 mL in plaats van 5 mL kolom en nikkel in plaats van kobalt ionen voor chromatografie van de affiniteit. Was de kolom met 10 kolom volumes van een wash-buffer met 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 80 mM imidazool pH 8,0 en 0,05% DDM.Opmerking: De imidazool-concentratie die kan worden gebruikt tijdens wast voor een 10-zijne-gelabeld eiwit is hoger dan algemeen wordt gewaardeerd en in een verbeterde zuiverheid resulteert. Elueer de proteïne in de buffer met 20 mM Tris pH 7.0, 200 mM NaCl, 10% glycerol, 300 mM imidazool pH 8,0 en 0,05% DDM. Verzamelen van het eluaat in tien 1 mL breuken en draaien op een 4-20% Tris-glycine SDS-pagina gel samen met ontbindend lysate en wassen breuken. Zwembad piek breuken, meestal ongeveer 5-6 mL en concentraat tot 500 µL of minder volume in een concentrator 50 kDa cutoff in een benchtop centrifuge gekoeld bij 4 ° C.Opmerking: 500 µL is een typische maximumvolume geïnjecteerd in grootte uitsluiting Chromatografiekolommen (SEC). Op dit punt het eiwit voor onbepaalde tijd kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C of blijven op de SEC. Filtreer de proteïne door een 0,2 µm filter voor de kolom van de spin en Injecteer op een grootte uitsluiting kolom (bijvoorbeeld Superdex-200) geëquilibreerd in S200 buffer: 20 mM Mes pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glycerol en 0,03% DDM.Opmerking: Voor de latere Glutaaraldehyde dwarsbinding assay, de buffering agent moet niet bevatten een primair amine. SEC is een mogelijkheid om te wisselen van buffers, indien nodig, zoals hier wordt gedaan, wanneer het uitwisselen van Tris voor Mes. Voer dat de piek breuken op een 4-20% Tris-glycine SDS-pagina gel. Vlekken van de gel pure piek breuken verzamelen en concentreren in een 50 kDa-cutoff-concentrator bij 4 ° C. De eiwitconcentratie bepalen door het meten van de extinctie bij een golflengte van 280 nm, en winkel voor onbepaalde tijd bij-80 ° C. 5. Glutaaraldehyde dwarsbinding Assay Bereid een 10 µL reactie door het mengen van 3 µL van 0, 5 mg/mL eiwitten in S200 buffer, 5 µL van S200 buffer, 1 µL van water of 20% natrium dodecyl sulfaat (SDS), gevolgd door 1 µL van 1,5% Glutaaraldehyde.Opmerking: Dit geeft een 1 x reactie van de eiwitten en 0,15% Glutaaraldehyde 0,15 mg/mL. Monsters met een voorbehandeling van SDS moeten zijn belangrijke negatieve controles worden gemengd en bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten geïncubeerd voordat u Glutaaraldehyde toevoegt. Incubeer de reactie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De reactie beëindigen door toe te voegen 5µL van 3 x SDS-pagina gel laden kleurstof, die bevat een overmaat van Tris buffer die het Glutaaraldehyde lest. Laden van alle 15 µL op 4-20% Tris-glycine SDS-pagina gel, die 1,5 µg eiwit per rijstrook zal laden. Voer de gel bij 200 V voor 30 min. vlek en bepalen van de omvang van het dimeer cross-linking door bewijs van een band die twee keer de grootte van de gedenatureerde monomeer prestatiestatus.Opmerking: Een Glutaaraldehyde titratie en tijdsverloop kunnen eerst worden uitgevoerd om te zoeken naar de beste voorwaarden voor een homomeric transporter.