التعبير، سولوبيليزيشن، وتنقية من الناقلين بورات حقيقية النواة
Summary
نقدم هنا بروتوكولا للتعبير عن، وجعل، وتنقية عدة بورات التوكسينات الناقلين بالتماثل للأسرة الناقل SLC4 باستخدام الخميرة. كما يصف لنا مقايسة cross-linking كيميائية لتقييم البروتينات هوموميريك المنقي للجمعية مولتيميريك. هذه البروتوكولات يمكن تكييفها للبروتينات الغشاء الصعبة الأخرى.
Abstract
الأسرة المذاب الناقل 4 (SLC4) من البروتينات يسمى الناقلين بيكربونات ويشمل البروتين التوراتية شاردة مبادل 1 (AE1، يعرف أيضا باسم الفرقة 3)، بروتين غشائي الأكثر وفرة في خلايا الدم الحمراء. الأسرة SLC4 مثلى مع الناقلين بورات، التي اتسمت في النباتات والفطريات. ما زال تحديا تقنيا كبيرا للتعبير عن وتنقية البروتينات الغشاء النقل إلى التجانس بكميات مناسبة لدراسات هيكلية أو وظيفية. هنا نحن تصف الإجراءات المفصلة ل overexpression الناقلين بورات في Saccharomyces cerevisiae، والعزلة الأغشية الخميرة، سولوبيليزيشن من البروتين من المنظفات، وتنقية بورات الناقل هومولوجس من س. سيريفيسيا، أعطيت التمويل، و أرز. ونحن أيضا بالتفصيل glutaraldehyde التجربة الاعتداء مولتيميريزيشن الناقلين هوموميريك العابرة للربط. إجراءاتنا المعمم يمكن تطبيقها على جميع البروتينات الثلاثة، وقد تم تحسين كفاءة. ويمكن استخدام العديد من الاستراتيجيات الموضوعة هنا لدراسة البروتينات الغشاء الصعبة الأخرى.
Introduction
وتظل صعوبة الحصول على كميات كافية من البروتين غشاء المنقي زجاجة في السعي لتحقيق دراسات الهيكلية والوظيفية للمستقبلات وقنوات أيون والناقلين. توجد العديد من البروتوكولات لخطوط الأنابيب الإنتاجية متوسطا للشاشة والعثور على بروتينات الغشاء المرشحة التي تعبر عن جيدا بما يكفي لتمكين اللاحقة في المختبر الدراسات1،2،3،4 . عادة، يتم المفتاحية البروتينات بروتين N أو ج-طرفية أخضر نيون (التجارة والنقل)، ويتم رصد مستويات التعبير بالأسفار بهلام أو بالأسفار-الكشف عن حجم الاستبعاد اللوني (فسك)5. تمكين هذه النهج فرز المرشحين بروتين الغشاء في البروتينات وإذ تعرب عن عالية، معتدلة أو منخفضة معربا عن البروتينات، أو البروتينات التي تعبر عن شكل سيء أو قد لا تعمل على الإطلاق. يعمل هذا الأسلوب أيضا عند التصميم التجريبي التحقيق في عدد كبير من الجينات المرشحة قصد تحديد أيهما البروتين تعرب عن الأفضل. ومع ذلك، في بعض الحالات، يستند نهج تجريبي دراسة بروتين غشاء خاص، التي يمكن أن تكون صعبة عندما تكون مستويات البروتين هذا التعبير في نطاق معتدلة أو منخفضة. بالإضافة إلى ذلك، في بعض الأحيان وفي هذه الحالات، مستويات التعبير يمكن فقط الحد الأدنى زيادة بتغيير بنية عن طريق ترونكيشنز أو الطفرات ثيرموستابيليزينج كودون الأمثل. ولذلك، في بعض الأحيان ضرورية لتحسين غشاء بروتين البروتوكولات التعبير وتنقية للبروتينات الغشاء تعبر فقط معتدلة جيدا.
وتشمل الأسرة SLC4 من الناقلين الناقل بيكربونات شاردة مبادل 1 (يعرف أيضا باسم الفرقة 3) وبروتين غشائي الأكثر وفرة في خلايا الدم الحمراء6، ومحرك رئيسي للتنفس الخلوي. الأسرة SLC4 مثلى مع الناقلين بورات، وحاسمة في النباتات وقد ثبت أن يحمل بنية مماثلة إلى شاردة مبادل 1 وكذلك إلى جانب الصوديوم SLC4 الناقلين7،،من89 ،10. هنا نحن تقرير البروتوكولات التعبير وتنقية البروتين الأمثل باستخدام S. cerevisiae لتنقية ثلاث ناقلات بورات مختلفة موجودة في الخميرة والنباتات. نسلط الضوء في التفصيل الخطوات الرئيسية أخذنا إلى تحسين الغلة وكفاءة تنقية للتجانس. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا تقرير مقايسة cross-linking كيميائية باستخدام جلوتارالديهيدي لرصد الجمعية مولتيميريك لمتعهدي النقل هذه في سياق معقد البروتين-المنظفات-الدهن المنقي. التجربة كروسلينكينج يمكن أن تساعد في تقييم مدى ملاءمة هومولوج والمنظفات بتقييم حالة الناقلين oligomeric مولتيميريك بعد تنقية.
ويفترض هذا البروتوكول أن الناقل المطلوبة قد تم استنساخ في بلازميد 2 μ المستمدة تحت السيطرة إيندوسيبلي من المروج GAL1 للتعبير في S. cerevisiae. الحمض النووي لهذه الإجراءات، كان يستخدم ترميز طول البرية من نوع بورات الناقلين Bor1 Saccharomyces cerevisiae (ScBor1)11، التمويل نبات Bor1 (AtBor1)12، و أرز Bor3 (OsBor3)13 . ج-المحطة في كل بناء يتم إلحاق مع 10-صاحب-علامة وموقع انقسام ثرومبين إدراجها بين الناقل و 10-صاحب-العلامة لتمكين إزالتها إذا رغبت. وسيتولى البروتوكول أيضا أن بلازميد قد تحولت فعلا إلى دسي-5 التعبير سلالة من S. cerevisiae في وسائل الإعلام الانتقائي تكميلية كاملة (CSM) التي تفتقر إلى الحامض الأميني.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا تقاسمنا بروتوكولات مفصلة تؤدي إلى التنقية لتجانس ثلاثة متميزة بورات التوكسينات الناقلين. البروتوكولات المقدمة هنا مستقاة من البروتوكولات الأخرى للتعبير عن البروتينات الغشاء لا يتجزأ في1، S. cerevisiae14، ولدينا نتيجة لتحسين الأداء في نقاء المحسنة وتحسين المحاصيل. المعلمات الأمثل هنا تشمل حجم نمو ثقافة الخلية ومرات، وضرب حبة تحلل الإجراءات، تكوين المخزن المؤقت أثناء تحلل الخلية وتحديد تنقية البروتين، كمية من المنظفات المستخدمة لكل غرام غشاء، أيون معدني في انجذاب تطهير، حجم العمود تقارب، وتنفيذ مقايسة cross-linking لتقييم مدى ملاءمة هومولوج والمنظفات بتقييم حالة الناقلين oligomeric مولتيميريك. البروتوكولات ناجحة بالنسبة هومولوجس SLC4 متعددة من النباتات والفطريات. حد من جميع الاستراتيجيات لتنقية البروتينات الغشاء لا يتجزأ هو أنه لا يوجد أي أسلوب تنقية البروتين غشاء عالمية مضمونة للعمل. فمن الممكن أن لدينا بروتوكولات أكثر احتمالاً لتكون ناجحة للبروتينات أقرب في تسلسل الهوية وهيكل للناقلين SLC4، ومن ثم أعضاء أسر SLC4 و SLC23 و SLC26 يمكن أن تكون واعدة تستهدف15. وبالمثل، أكثر تقحم بعيدة من الناقلين بورات الناقل غشاء قد يكون، على الأرجح البروتوكول يجب أن تكون مختلفة، كما هو الحال باختلاف نظام التعبير أو المنظفات الأخرى البارامترات الرئيسية4.
البروتوكول يستفيد من علامة تقارب الأكثر استخداماً في تنقية البروتين، له العلامة. على الرغم من وجود شوائب في كسور التيد الأولية، ينتج التركيبات من تقارب النيكل والغسيل واسعة النطاق، واللاحقة ثانية تنقية البروتين المنقاة العالية. 10-صاحب-علامة يسمح ليغسل ايميدازول أكثر صرامة، وهكذا يمكن إزالة خلفية ملزم البروتينات أكثر مما يمكن إزالتها في يغسل يسمح بها 8-صاحب-أو 6-صاحب-العلامات. لدينا تحديدات للكسور نقية يخطئ الجانب المحافظ من معظم الكسور جل نقية جداً، التي تتوافق مع كسور ثانية الذروة. يمكن زيادة غلة البروتين النهائي من خلال تجميع وتركيز المزيد من الكسور، أن كان ذلك بمفاضلة بروتين النقي أقل قليلاً. الأساليب المقدمة هنا تمكين تنقية AtBor1 في الكميات التي أدت إلى تحديد هيكل الكريستال7، مع اختلافات تنقية تتكون من قطع علامة له وتبادل الناقل في مختلف المنظفات لتحسين كريستال حيود7.
ويثير لدينا بروتوكول اعتبارات هامة للاختيار هومولوجس والمنظفات المستخدمة لجعل وتنقية لها. DDM خيار أول مشترك للمنظفات لأنه معتدل نسبيا، وغالباً ما تنجح في سولوبيليزينج، وقد استخدمت في دراسات هيكلية ووظيفية لمجموعة متنوعة من البروتينات الغشاء. في تحديد ما إذا كان منظفات تشكيلة فقيرة لغشاء، أسلوب مشترك لتقييم ما إذا كان البروتين يعطي ذروة مونوديسبيرسي واحد في تشروماتوجرام ثانية، بدلاً من ذروة كبيرة في حجم الفراغ أو مجموعة من قمم بوليديسبيرسي، الذي وتشير إلى البروتين تجمعات أو غير مستقرة. نظر بشكل أكثر مكرا يثير لدينا تنقية ScBor1. ينقي بكميات كبيرة وتبدو مواتية ومونوديسبيرسي في تشروماتوجرام ثانية، مما يوحي بأنه يمكن أن يكون هدفا جذاباً للدراسات الهيكلية. ومع ذلك، يكشف لدينا الإنزيم cross-linking فإن مونومر عند تنقية. وفي حين أنه من الممكن أن ScBor1 يمكن أن توجد أصلاً مونومر في الخلية، تشير الدراسات إلى أن الناقلين SLC4 وما هومولوجس من المحتمل أن dimers7،،من89،10. تنميتنا للمقايسة cross-linking حدث بعد بلورة وحل بنية AtBor1. ومع ذلك، تسنى لنا لتقييم ScBor1 بالمقارنة مع AtBor1 مع الإنزيم كروسلينكينج، جهودا قيمة الوقت والبحث قد تم إعادة توجيه إلى السعي إلى AtBor1 بدلاً من ScBor1، هذه الأخيرة في نهاية المطاف لم يكن ناجحاً في التجارب تبلور والحيود. يمكن أن يساعد هذا الإنزيم وبالتالي الباحثين التمييز بين هومولوجس أو المنظفات لاستخدامها عند متابعة الدراسات الهيكلية من أجل إعطاء الأولوية للأوضاع التي يحافظ البروتين تكيف أصلية المشتبه فيهم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامها في التحليل للتحقيق من الأحماض الأمينية التي هي حاسمة بالنسبة مولتيميريزيشن، بغية إيجاد بدائل من الأحماض الأمينية التي تزعزع استقرار واجهة مولتيميريزيشن وتؤدي إلى إلزام مونومرات. وقد استخدم هذا نهج للتحقيق الفنية أهمية الجمعية هوموميريك في غشاء الناقلين16،،من1718.
ميزة عامة لأسلوبنا أن الخميرة قد ثبت تمكينا للتعبير عن العديد من البروتينات الغشاء تحديا لوظيفة متنوعة1. بالإضافة إلى ذلك، عصرها منخفضة التكلفة والنمو تعزيز إمكانية الوصول إليها للعديد من الجهود البحثية التي قد تكون أقل قدرة على استخدام استراتيجيات التعبير التي تتطلب زراعة الأنسجة أو وسائط النمو باهظة الثمن. الإجراءات المعروضة هنا هي غير مكلفة نسبيا ويمكن أن يؤديها في أسبوع واحد مما يؤكد جدوى النهج. يمكن أن يساعد تنفيذ هذه البروتوكولات تمكين الدراسات الهيكلية والوظيفية للبروتينات الغشاء الصعبة الأخرى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث أموال بدء التشغيل في كلية ديفيدسون.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
| Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
| Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
| Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
| Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
| Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
| D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
| Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
| Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imidazole | Acros | 12202 | |
| Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
| JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
| JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
| Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
| Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
| Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
| p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
| Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
| Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
| S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
| Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
| Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
| Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
| YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 | |
References
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Andréll, J., Tate, C. G. Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Molecular Membrane Biology. 30 (1), 52-63 (2013).
- Lyons, J. A., Shahsavar, A., Paulsen, P. A., Pedersen, B. P., Nissen, P. Expression strategies for structural studies of eukaryotic membrane proteins. Current Opinion in Structural Biology. 38, 137-144 (2016).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
- Thurtle-Schmidt, B. H., Stroud, R. M. Structure of Bor1 supports an elevator transport mechanism for SLC4 anion exchangers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10542-10546 (2016).
- Coudray, N., et al. Structure of the SLC4 transporter Bor1p in an inward-facing conformation. Protein Science. 26 (1), 130-145 (2016).
- Arakawa, T., et al. Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3. Science. 350 (6261), 680-684 (2015).
- Huynh, K. W., et al. CryoEM structure of the human SLC4A4 sodium-coupled acid-base transporter NBCe1. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Zhao, R., Reithmeier, R. A. Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae. American Journal of Physiology Cell Physiology. 281 (1), 33-45 (2001).
- Takano, J., et al. Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature. 420, 337-340 (2002).
- Nakagawa, Y., et al. Cell-type specificity of the expression of Os BOR1, a rice efflux boron transporter gene, is regulated in response to boron availability for efficient boron uptake and xylem loading. Plant Cell. 19 (8), 2624-2635 (2007).
- Hays, F. A., Roe-Zurz, Z., Stroud, R. M. Overexpression and purification of integral membrane proteins in yeast. Methods in Enzymology. 470, (2010).
- Chang, Y. -. N., Geertsma, E. R. The novel class of seven transmembrane segment inverted repeat carriers. Biological Chemistry. 398 (2), 165-174 (2017).
- Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Design, function and structure of a monomeric ClC transporter. Nature. 468 (7325), 844-847 (2010).
- Last, N. B., Miller, C. Functional Monomerization of a ClC-Type Fluoride Transporter. Journal of Molecular Biology. 427 (22), 3607-3612 (2015).
- Yu, X., et al. Dimeric structure of the uracil:proton symporter UraA provides mechanistic insights into the SLC4/23/26 transporters. Cell Research. 27 (8), 1020-1033 (2017).
